Ετερόλογη έκφραση και καθορισμός του ενζύμου L-ασπαραγινάση

Abstract

L-asparaginases (L-asparagine amidohydrolase, EC 3.5.1.1) are enzymes, which primarily catalyze the deamidation of L-Asn to produce L-Asp and ammonia, but simultaneously, have the ability to hydrolyze to a lesser extent, L-Gln to L-Glu and ammonia. The functional form of LASNase

exists as a tetramer of identical subunits, with molecular mass in the range of 140-160 kDa. Two types of bacterial L-ASNases have been identified and characterized, type I and type II. Type I L-ASNases are expressed constitutively in the cytoplasm and hydrolyze L-Asn and LGln

with the same rate. Type II L-ASNases are expressed under anaerobic conditions and are periplasmic enzymes, which exhibit high specific activity against L-Asn. For the past 30 years, L-ASNases II have been used as therapeutic enzymes in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. The anti-neoplastic activity results from cellular protein synthesis inhibition due to the depletion of the circulating pools of L-Asn by L-ASNase. In contrast to normal cells, malignant cells can only synthesize L-Asn slowly and hence, their survival depends on an exogenous supply. Particularly, therapeutic forms from bacterial sources have been studied such as Erwinia caratovora, Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli. The present study focused on L-ASNase II from Erwinia chrysanthemi 3937 (Ec-ASNase) with three main aims: i) study and optimization of the extracellular expression of Ec-ASNase in E. coli using its native peptide leader, ii) development and optimization of an efficient purification protocol for the extracellular enzyme and iii) immobilization of the L-ASNase using glutaraldehyde as a cross-linking agent. Successful immobilization could offer the possibility of designing and developing a bioreactor, which could be used in leukemia therapy. Seven different E.coli strains were studied for their ability to secrete the recombinant enzyme in the culture medium. The strain, which exhibited the highest expression levels, BL21(DE3) Rosetta, was chosen for further analysis. Additionally, extracellular expression levels were evaluated at 18 ºC and 37 ºC using 3 different culture media (LB, TB, YT). The results showed, that after 36 hours of expression, approximately 18.000 IU and 5 mg of L-ASNase were secreted in 1 L TB culture medium. Regarding purification, we found that ion exchange chromatography is inappropriate for the purification of the extracellular enzyme. Hence, we focused on the 1 development of three affinity absorbents, for the chromatographic purification of the enzyme. We used L-Asn, L-Glu and L-Asp as ligands, which were immobilized on Sepharose CL-6B using bis-oxirane chemistry. L-Asp ligand showed the highest purifying ability and hence, the optimized purification protocol was developed using L-Asp as affinity ligand. Eventually, we found that optimum purification can be achieved using 0.1 M NaCl and 20 mM Pi, pH 7.5, as far as the supernatant conditions are concerned. Furthermore, in order to evaluate the effectiveness of the optimized purification protocol for other L-ASNases II, such as the recombinant enzymes from Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli, we isolated, cloned and expressed the respective genes in E.coli BL21(DE3) Rosetta cells. These enzymes were not bound the column indicating the high specificity of immobilized L-Asp and Erwinia chrysanthemi L-ASNase under the experimental conditions (e.g. 0.1 M NaCl, 20 mM Pi, pH 7.5). As a last stage of this project, L-ASNase was immobilized using glutaraldehyde as a cross-linking agent and BSA. Four UI of the enzyme were immobilized under 9 different conditions and the condition which demonstrated the highest efficiency, was chosen in order to determine the enzyme’s operational stability using as control the free enzyme. The results showed, that after 65 days, the immobilized enzyme retains about 48 % of its initial activity, whereas the free only 15 %.

Οι L-ασπαραγινάσες (αμιδο-υδρολάσες της L-ασπαραγίνης, L-ASNase, E.C. 3.5.1.1) αποτελούν ένζυμα, τα οποία καταλύουν τη υδρόλυση της L-ασπαραγίνης σε L-ασπαρτικό οξύ και αμμωνία. Επιπλέον, οι L-ASNases διαθέτουν την ικανότητα να υδρολύουν και την L-γλουταμίνη. Ειδικότερα, με βάση τη συγγένειά τους ως προς τα δύο υποστρώματα, την L-ασπαραγίνη και την L-γλουταμίνη, οι βακτηριακές L-αμιδο-υδρολάσες κατατάσσονται σε δύο κλάσεις: στη πρώτη κλάση ανήκουν εκείνα τα ένζυμα, τα οποία πρωταρχικώς υδρολύουν την L-ασπαραγίνη και κατ’επέκταση παρουσιάζουν μεγαλύτερη συγγένεια ως προς την L-ασπαραγίνη εν συγκρίση με την L-γλουταμίνη και στη δεύτερη κλάση ανήκουν ενζυμικά μόρια, τα οποία καταλύουν την υδρόλυση της L-ασπαραγίνης και της L-γλουταμίνης με παράλληλη αποτελεσματικότητα. Οι L- ASNases είναι ενεργές μόνο ως τετραμερή, τα οποία παρουσιάζουν μια συμμετρία τύπου 222, και χαρακτηρίζονται απο ένα εύρος μοριακής μάζας 140-150 kDa. Κάθε μονομερές αποτελείται απο περίπου 330 αμινοξικά κατάλοιπα, ο συνδυασμός των οποίων, σχηματίζει 14 β-πτυχωτές επιφάνειες και 8 α-έλικες. Η δομή ενός μονομερούς χαρακτηρίζεται απο 2 διακριτές περιοχές: μια μικρότερη C-τελική περιοχή και μια μεγαλύτερη N-τελική περιοχή, οι οποίες συνδέονται με μια αλληλουχία 20 αμινοξικών καταλοίπων. Οι L-ASNases κατατάσσονται σε 2 τύπους: στον τύπο Ι και στον τύπο ΙΙ. O τύπος Ι περιλαμβάνει τις L-ASNases, οι οποίες εκφράζονται στο κυτταρόπλασμα και χαρακτηρίζονται απο παρόμοια συγγένεια ως προς την L-ασπαραγίνη και την L-γλουταμίνη. Αντίστοιχα, ο τύπος ΙΙ των L-ASNases, εμφανίζει μια υψηλή συγγένεια για την L-ασπαραγίνη και μια πολύ μικρότερη για την L-γλουταμίνη. Για το λόγο αυτό, αυτού του τύπου οι L-ASNases χρησιμοποιούνται ως χημειοθεραπευτικά ένζυμα στη περίπτωση της λευχαιμίας και συσπειρώνουν μεγάλο επιστημονικό και ερευνητικό ενδιαφέρον. Οι συγκεκριμένες L-ASNases χαρακτηρίζονται απο βακτηριακή πηγή προέλευσης, με κυριότερους εκπροσώπους τα στελέχη Escherichia coli, Erwinia chrysanthemi και Erwinia caratovora. Στη παρούσα πειραματική μελέτη, αναπτύχθηκε ένα βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο ετερόλογης έκφρασης, (χρησιμοποιώντας ως ετερόλογο σύστημα έκφρασης το E. coli) καθαρισμού και ακινητοποίησης, για την εξωκυττάρια L-ASNase ΙΙ του βακτηριακού στελέχους Erwinia chrysanthemi 3937. Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε η έκφραση του ενζύμου σε 7 διαφορετικά στελέχη E. coli και διερευνήθηκε η πιθανότητα εξωκυττάριας παραγωγής του συγκεκριμένου ενζύμου. Τέσσερα απο τα επτά στελέχη, έδειξαν ότι παράγουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη 3 εξωκυττάρια στο θρεπτικό μέσο και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη, εκείνο, το οποίο παρουσίασε τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης. Το στέλεχος αυτό είναι το BL21(DE3) Rosetta. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν τρεία διαφορετικά θρεπτικά μέσα, ΤΒ, ΥΤ και LB και δύο διαφορετικές θερμοκρασίες έκφρασης 18 oC και 37 oC, με σκοπό τον προσδιορισμό των συνθηκών, κάτω απο τις οποίες μπορούν να επιτευχθούν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης. Τελικά προέκυψε, ότι υψηλότερα επίπεδα εξωκυττάριας έκφρασης, επιτυγχάνονται χρησιμοποιώντας το θρεπτικό μέσο ΤΒ σε θερμοκρασία 37 oC. Ειδικότερα, μετά απο 36 ώρες έκφρασης, παρήχθησαν περίπου 18.000 IU and 5 mg L-ASNase σε 1 L TB θρεπτικό μέσο. Όσον αφορά τον καθαρισμό, προσδιορίστηκε, ότι η χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι ακατάλληλη για τον καθαρισμό του εξωκυττάριου ενζύμου και για το λόγο αυτό οι προσπάθειες στράφηκαν προς την χρωματογραφία συγγένειας. Μελετήθηκαν τρείς διαφορετικοί προσροφητές συγγένειας, χρησιμοποιώντας ως δεσμευτές τις ενώσεις L-Asn, L-Glu και L-Asp και επιλέχθηκε ο προσροφητής με ακινητοποιημένο δεσμευτή το L-Asp, καθώς παρουσίασε υψηλότερες αποδόσεις καθαρισμού. Με βάση τον προσροφητή αυτόν, προσδιορίστηκε ότι οι βέλτιστες συνθήκες προσρόφησης στη στήλη, είναι τελικά 0.1 M NaCl και 20 mM Pi, pH 7.5. Παράλληλα, διερευνήθηκε και η πιθανότητα εφαρμογής του βελτιστοποιημένου πρωτοκόλλου καθαρισμού και για άλλες ανασυνδυασμένες L-ASNases όπως απο Escherichia coli και Erwinia caratovora. Τελικά οι L-ASNases αυτές, δεν προσροφούνται στον προσροφητή κάτω απο τις βέλτιστες συνθήκες. Τέλος, η εξωκυττάρια L-ASNase του στελέχους Erwinia chrysanthemi 3937 ακινητοποιήθηκε χρησιμοποιώντας γλουταραλδεΰδη ως διδραστικό αντιδραστήριο, κάτω απο εννέα διαφορετικές συνθήκες. Απο τις συνθήκες αυτές, επελέγη εκείνη, η οποία επέδειξε την υψηλότερη απόδοση, με στόχο τη συγκριτική μελέτη της λειτουργικής σταθερότητας του ενζύμου σε ακινητοποιημένη και ελεύθερη μορφή. Μετά απο 65 ημέρες συγκριτικής μελέτης, το ακινητοποιημένο ένζυμο διατηρεί το 48 % της αρχικής δραστικότητάς του, ενώ το ελεύθερο μόλις το 15 %.