Γενετικός μετασχηματισμός στο είδος Nicotiana benthamiana με γονίδια φυτοπαθογόνων βακτηρίων

Abstract

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η συνεξέλιξη μεταξύ φυτών ξενιστών και φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών χαρακτηρίζεται από μία συνεχή μάχη, οπού η εξέλιξη των μικροοργανισμών περιλαμβάνει την κατοχή πρωτεϊνών-τελεστών που μεταβάλλουν προς όφελος τους την πρωτογενή και δευτερογενή άμυνα του ξενιστή. Η ανταπόκριση από μέρους των φυτών περιλαμβάνει την αναγνώριση των συγκεκριμένων πρωτεϊνών-τελεστών και την επακόλουθη ενεργοποίηση διαδοχικών επιπέδων άμυνας ώστε να καθίσταται ικανή η τοπική και διασυστηματική άμυνα έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών. Στόχο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η δημιουργία διαγονιδιακών φυτών Nicotianabenthamianaμε το γονίδιο HpaA, το οποίο έχει χαρακτηρισθεί ως πρωτεΐνη–τελεστής με άγνωστη λειτουργία,προκειμένου να μελετηθεί η επίδρασή του υπό συνθήκες καταπόνησης με το βακτήριο Pseudomonassyringaepv. tabaci. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της διαγονιδιακής έκφρασης του γονιδίου HpaA, παράλληλα με την εφαρμογή σταθερού μετασχηματισμού που αποτελεί χρονοβόρα και δύσκολη διαδικασία, αξιοποιήθηκε και η μεθοδολογία δημιουργίας διαγονιδιακών ριζών ζαχαρότευτλου μέσω του Α.rhizogenes. Από τα πειράματα παροδικού μετασχηματισμού των δύο ποικιλιών τεύτλου, Αλεξάνδρα και Πανδώρα, φάνηκε ότι το ριζικό σύστημα των μετασχηματισμένων φυτών διαφοροποιήθηκε συγκριτικά με αυτό των φυτών-μαρτύρων, παρέχοντας ενδείξεις ότι οι παρατηρηθείσες νεκρώσεις πιθανόν να συνδέονται με καθυστερημένη επαγωγή της αντίδρασης υπερευαισθησίας, ενώ παράλληλα δε μπορεί να αποκλειστεί η υπόθεσηύπαρξης τοξικής επίδρασης. Ο σταθερός μετασχηματισμός στο φυτό μοντέλο N.benthamiana επέτρεψε την ανάπτυξη διαγονιδιακών φυτών παρά τις χαμηλές συχνότητες μετασχηματισμού και αναγέννησης. Επιπλέον, τα φυτά της Τ1 γενεάς χαρακτηρίστηκαν από φυσιολογική ανάπτυξη και από τα πειράματα βιοτικής καταπόνησης μέσω τεχνητής μόλυνσης με το βακτήριο Pseudomonas syringae pv. tabaci παρατηρήθηκε ότι, ενώ αναφορικά με την αποίκιση του βακτηρίου δεν υπήρξαν ουσιαστικές διαφοροποιήσεις μεταξύ διαγονιδιακών φυτών και μαρτύρων, τα πρώτα χαρακτηρίζονταν από καθυστερημένη και ηπιότερη ανάπτυξη συμπτωμάτων, γεγονός το οποίο πιθανόν να οφείλεται στην ενδογενή επίδραση του γονιδίου στη βασική άμυνα του φυτού. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προκύπτουν ενδείξεις που συνδέουν τη δράση του γονιδίου HpaA με την ενίσχυση της βασικής άμυνας των φυτών (που δεν αποτελούν φυσικό ξενιστή της ξανθομονάδας), αλλά δεδομένου ότι η παρούσα εργασία αποτελεί την πρώτη αναφορά για τη μελέτη της έκφρασης του γονιδίου HpaA σε φυτά, καθίσταται σαφές ότι χρειάζονται πολύ περισσότερες πληροφορίες προκειμένου να διεξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα.

ABSTRACT The coevolution between host plants and phytopathogenic microorganisms is characterized by a constant battle, where the evolution of microorganisms involves the possession of effector proteins that alter, for their advantage, the primary and secondary host's defense. Plant response includes the recognition of specific effector proteins and subsequent activation of successive levels of defense in order to enable local and systemic defense against pathogens. The aim of this work was the production of transgenic Nicotiana benthamiana plants harbouring HpaA gene, which has been designated as effector protein with unknown function, in order to study its effect under stress conditions, induced by infection with the bacterium Pseudomonas syringae pv. tabaci. To investigate the effect of transgene expression of HpaAgene, while implementing stable transformation,a time consuming and laboriousprocess,A.rhizogenes-mediated generation of transgenic sugar beet roots has been employed. Transient transformation ofboth sugar beet varieties, Alexandra and Pandora, revealed that the root system of transformed plants varied from that of control plants thus, providing evidence that the observed necrosis may be associated with delayed induction of hypersensitivity reaction, while the hypothesis of toxic effects cannot be excluded. Despite the low frequencies of transformation and regeneration, table transformation ofthe model plantN. benthamiana,enabled the development of transgenic plants, which exhibited a normal phenotype both at the T0 and T1 generations. Moreover, our findings demonstrate that althoughartificial infection with the bacterium Pseudomonas syringaepv. tabaci results insimilar levels of bacterial colonization between control and transgenic plants, the first were characterized by delayed and mild symptom development, which may be due to the effect of endogenous gene expression acting towards enhancingthe basic defense of the plant. Overall results provide evidence that the activity of the HpaAgenemight strengthen basic defense of non-host plants. However, as the present workconstitutes the first study of HpaAgene expression in plants, it is obviousthat further experiments are required in order to draw robust conclusions regarding a possible correlation between transgene expression and plant resistance against biotic stresses.