Μελέτη της δομής και της έκφρασης γονιδίων που μετέχουν στο μεταβολισμό πουρινών στο ριζόβιο Sinorhizobium meliloti

Abstract

H συμβιωτική αζωτοδέσμευση λαμβάνει χώρα στις ρίζες των ψυχανθών φυτών σε ειδικά οργανίδια, τα οποία ονομάζονται φυμάτια, και σχηματίζονται κατά τη συμβίωση ενός ψυχανθούς με συγκεκριμένου τύπου βακτήρια, που ονομάζονται ριζόβια. Τα ριζόβια μολύνουν τις ρίζες των ψυχανθών, και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε ειδικές συμβιωτικές μορφές (βακτηροειδή), οι οποίες μπορούν να δεσμεύσουν ατμοσφαιρικό άζωτο (Ν2) το οποίο θα χρησιμοποιηθεί από το ψυχανθές. Το φυμάτιο αποτελεί ένα ειδικό περιβάλλον, το οποίο απαιτεί αλλαγές στο μεταβολισμό από πλευράς ριζοβίων, έτσι ώστε να προσαρμοστούν σε αυτό το νέο περιβάλλον. Κατά τη συμβίωση του ριζοβίου Sinorhizobium meliloti με το ψυχανθές Medicago truncatula, σχηματίζονται μη-καθορισμένου τύπου φυμάτια, στα οποία δημιουργείται συνεχώς νέος ιστός μέσω της λειτουργίας του επάκριου μεριστώματος, καθώς και συνεχής διαφοροποίηση βακτηροειδών που μολύνουν τον κεντρικό ιστό. Αυτό οδηγεί σε συνεχή ανάγκη παροχής νουκλεοτιδίων, και υποδεικνύει ότι μία ενεργή μεταφορά και ένα ενεργό μεταβολικό μονοπάτι πουρινών μπορεί να έχει σημαντικό ρόλο κατά τη συμβιωτική αζωτοδέσμευση. Οι πουρίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν είτε ως συστατικά των νουκλεοτιδίων (de novo σύνθεση ή περίσωση πουρινών), είτε ως πηγές αζώτου κατά τον καταβολισμό τους. Σκοπός αυτής της εργασίας είναι μελετηθεί το πρότυπο έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν για ένζυμα που συμμετέχουν στο μονοπάτι του μεταβολισμού των πουρινών, καθώς και για μεταφορείς πουρινών, στο ριζόβιο S. meliloti. Για την επίτευξη αυτού του στόχου εντοπίστηκαν τα γονίδια αυτά σε δημόσιες βάσεις δεδομένων, σχεδιάστηκαν εξειδικευμένα ζεύγη εκκινητών και στη συνέχεια, με τη μέθοδο του ποσοτικού PCR πραγματικού χρόνου μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων σε φυμάτια 14, 21 & 28 ημερών του φυτού M. truncatula μολυσμένο με ριζόβια S. meliloti 1021, καθώς και ελεύθερα διαβιούντων S. meliloti 1021 στην εκθετική και στατική φάση ανάπτυξής τους, τα οποία είχαν αναπτυχθεί με διαφορετική, μοναδική πηγή αζώτου (NH4, ξανθίνη, ουρικό οξύ). Παρατηρήθηκε επαγωγή των ενζύμων καταβολισμού και μεταφορέων στους χειρισμούς ξανθίνης και ουρικού οξέος των ελεύθερα διαβιούντων ριζοβίων, καθώς και επαγωγή ορισμένων ενζύμων ή υπομονάδων τους στα φυμάτια (SMc01533, SM_b21558, SM_b21284, SM_b21283). Τέλος, παρατηρήθηκε επαγωγή στα φυμάτια ενός μεταφορέα ξανθίνης (SMc02513).

Symbiotic nitrogen fixation (SNF) takes place in the roots of legumes plants, in organelles known as nodules. Nodules are formed during the symbiosis of a legume, with a host-specific strain of bacteria, known as rhizobia. Rhizobia infect the plant roots and subsequently differentiate to nitrogen fixating bacteroids. The nodule represents a special environment that requires metabolic changes for the adaptation of the bacteria in these new conditions. During symbiosis of Sinorhizobium meliloti with Medicago truncatula, indeterminate type nodules are formed, which maintain an active apical meristem that produces new cells over the life of the nodule, which in turn differentiate to bacteroids increasing their cell size and undergoing DNA endoreplication. This results in a constant need for nucleotide provision and implies that active purine transport and metabolism can play a significant role during SNF. Purines can be used either as nucleotide constituents (de novo synthesis or purine salvage), or as nitrogen sources during their catabolism. The objective of this study is the study of genes coding for, enzymes belonging to the purine metabolic pathway and purine transporters in rhizobia S. meliloti 1021. For this purpose genes of interest were identified in public databases. Then, using the method of quantitative real-time RT-PCR, the expression levels of these genes were measured in nodules harvested 14, 21 & 28 days post inoculation, of the plant M. trumcatula infected with S. meliloti 1021 and free-living S. meliloti 1021 bacteria developed with a different, sole nitrogen source (NH-4, xanthine and uric acid) in their exponential and stationary growth phase. Genes belonging to the catabolic part of the purine metabolic pathway were upregulated in the growth media containing xanthine & uric acid, and also certain genes coding for enzymes or enzymatic subunits were upregulated during nodulation (SMc01533, SM_b21558, SM_b21283, SM_b21284). One permease (SMc02513) was found to be highly upregulated in the nodules.