Μελέτη αλληλεπίδρασης κυκλοδεξτρινών με το ένζυμο hGSTA1-1

Abstract

Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολικοσακχαρίτες και αποτελούνται από μόρια α-D- γλυκοπυρανόζης. Στην υδρόφοβη εσωτερική κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών μπορούν να δεσμευθούν βιοδραστικές ενώσεις σχηματίζοντας σύμπλοκα έγκλεισης. Μέσω της συμπλοκοποίησης επιτυγχάνεται αύξηση της διαλυτότητας, βελτίωση της σταθερότητας και της βιοδιαθεσιμότητας των βιοδραστικών ενώσεων καθώς και η μείωση των παρενεργειών τους. Το ένζυμο hGSTA1-1 ανήκει στην οικογένεια των μεταφορασών της γλουταθειόνης (glutathione S-transferases, GSTs) τα οποία είναι πολυλειτουργικά ένζυμα του κυττάρου που συμμετέχουν σε μηχανισμούς αποτοξίνωσης αδρανοποιώντας εξωγενείς ή ενδογενείς τοξικούς παράγοντες, δημιουργώντας λιγότερο βλαβερές μορφές τους. Λόγω του σημαντικού αποτοξινωτικού ρόλου τους, αποτελούν μια από τις πιο μελετημένες τάξεις των ενζύμων. Σε επίπεδο εφαρμογών, τα ένζυμα αυτά αποτελούν ένα σημαντικό εργαλείο τόσο σε ερευνητικό όσο και σε βιομηχανικό επίπεδο. Ένα από τα προβλήματα που θα πρέπει όμως να αντιμετωπιστεί είναι η αστάθεια που εμφανίζουν τόσο σε λειτουργικό όσο κι σε αποθηκευτικό επίπεδο. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της παρουσίας β-κυκλοδεξτρίνης στην δραστικότητα και σταθερότητα του ενζύμου hGSTA1-1. Αρχικά πραγματοποιήθηκε ετερόλογη έκφραση και καθαρισμός του ενζύμου μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Με το καθαρό ένζυμο έγινε κινητική μελέτη της καταλυτικής αντίδρασης ως προς τα υποστρώματα GSH και CDNB παρουσία και απουσία β-κυκλοδεξτρίνης. Στη συνέχεια έγινε μια σειρά πειραμάτων με στόχο τη μελέτη των μεταβολών που παρατηρούνται στα θερμοδυναμικά μεγέθη που χαρακτηρίζουν το σύμπλοκο hGSTA1-1 και β-CD. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η παρουσία της β-CD επιδρά θετικά στην ενζυμική δραστικότητα και στην πορεία της ενζυμικής αντίδρασης κάτω από συνθήκες στρες του ενζύμου, όπως η υψηλή και η χαμηλή θερμοκρασία και τα ακραία pH, αλλά δεν επιδρά θετικά κατά την λυοφιλίωση του ενζύμου. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της β-CD στη σταθερότητα του ενζύμου παρουσία ενώσεων που προκαλούν αποικοδόμηση όπως η χυμοθριψίνη και η θρυψίνη, και ενώσεις που προκαλούν μετουσίωση όπως η ουρία. Τα πειράματα 9 έδειξαν ότι το υπό μελέτη ένζυμο σταθεροποιείται σε μεγάλο βαθμό διότι εμποδίζεται η αντίδραση και η αλληλεπίδραση με άλλα μόρια, όπως η χυμοθριψίνη, και η ουρία. Αντίθετα, στην περίπτωση της θρυψίνης, η παρουσία της β-κυκλοδεξτρίνης στο ρυθμιστικό διάλυμα επηρεάζει αρνητικά τη δραστικότητα του ενζύμου λόγω της αύξησης της δραστικότητας του ενζύμου της θρυψίνης.Συμπερασματικά οι μετρήσεις που έγιναν, έδωσαν πληροφορίες για την επίδραση της β-κυκλοδεξτρίνης στην δραστικότητα και δομική σταθερότητα του ενζύμου και έδειξαν ότι, παρουσία β-κυκλοδεξτρίνης, σε κάποιες περιπτώσεις επιτυγχάνεται η βελτίωση της σταθερότητας και δραστικότητας του ενζύμου.

Cyclodextrins are cyclic oligosaccharide compounds consisting of a-D-glucopyranose units. Cyclodextrins are able to form host-guest complexes because their hydrophobic cavity provides a microenvironment able to bind hydrophobic molecules. Through complexing, increase of solubility, improvenent of stability and reduction of side effects of the guest bioactive compounds are achieved. The enzyme hGSTA1-1 belongs to the family of glutathione S-transferases (GSTs). GSTs are crucial enzymes in the cell detoxification process catalyzing the nucleophilic attack of glutathione (GSH) on toxic electrophilic substrates and producing a compound of lower toxicity. Given their significant detoxification role, they constitute one of the most well studied classes of enzymes. In terms of applications, these enzymes are an important tool in both the research and industrial settings. A problem that has yet to be addressed is the instability exhibited at both operational and a storage level. This work investigated the effect of β-cyclodextrin in the activity and stability of the enzyme hGSTA1-1. Initially, we performed heterologous expression and purification of the enzyme by affinity chromatography. Using the purified enzyme, we studied the kinetics of the catalytic reaction of the substrates GSH and CDNB, in the presence and absence of β-cyclodextrin. Furthermore, a series of experiments were performed in order to determine the changes in thermodynamic variables which characterize the complex of hGSTA1-1 and β-CD. The results revealed that the presence of β-CD has a positive effect on the enzymatic activity of the enzyme under conditions of stress, such as high or low temperatures and extreme pH, but has no positive effect in enzyme lyophilization. Finally, the effects of β-CD on enzyme stability were studied in the presence of enzymes that cause degradation as chymotrypsin and trypsin, and compounds that cause denaturation such as urea. The results showed that β-cyclodextrin exhibits a positive effect on enzyme stability because it reduces the interactions with and the effects of chymotrypsin and urea. On the other hand, in the case of trypsin, β-cyclodextrin has a negative effect on enzyme stability due to an apparent boost in the activity of trypsin. 11 In conclusion, this study investigated the effect of β-cyclodextrin in the activity and stability of this enzyme and has shown that presence of β-cyclodextrin has a positive effect on enzyme activity and stability under certain conditions.