Μελέτη εγκλεισμού p-κουμαρικού οξέος σε επτάκις (2,6-δι-Ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεξτρίνη

Abstract

Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολιγοσακχαριτες που παράγονται από το άμυλο με ενζυματική δράση. Αποτελούνται από γλυκοζιτικές μονάδες συνδεόμενες μεταξύ τους με α-(1,4) δεσμούς. Βρίσκουν εφαρμογή σε διάφορους τομείς όπως στα τρόφιμα, στη φαρμακευτική, στη κοσμετική, στη γεωπονία και στη χημεία γενικότερα. Η κυριότερη ιδιότητα τους είναι η δημιουργία προϊόντων εγκλεισμού. Η υδρόφοβη κοιλότητά τους και το υδρόφιλο εξωτερικό τους τις καθιστά κατάλληλα μόρια ξενιστές για τον εγκλεισμό διαφόρων ενώσεων. Ο εγκλεισμός σε κυκλοδεξτρίνες οδηγεί πολλές φορές σε ευνοϊκά αποτελέσματα όπως είναι η αύξηση της διαλυτότητας της ξενιζόμενης ένωσης, η αργή απελευθέρωσή της καθώς και η προστασία της από παράγοντες όπως το φως και η οξείδωση. Πέραν των φυσικών κυκλοδεξτρινών, έχουν δημιουργηθεί και χημικά τροποποιημένες κυλοδεξτρίνες με βελτιωμένες ιδιότητες, κυρίως με την υποκατάσταση των υδροξυλομάδων τους. Χαρακτηριστικές περιπτώσεις είναι τα παράγωγα της β-κυκλοδεξτρίνης που προκύπτουν από τη μεθυλίωση των 2,6 [επτάκις-(2,6-δι-Ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεξτρίνη ή DIMEB] και 2,3,6 [επτάκις-(2,3,6-τρι-Ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεξτρίνη ή TRIMEB] υδροξυλομάδων τους. Οι μεθυλιωμένες αυτές β-κυκλοδεξτρίνες έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον αφού εμφανίζουν σημαντικά αυξημένη υδατοδιαλυτότητα και εύκαμπτη υδροφοβική κοιλότητα. Το p-κουμαρικό οξύ είναι ένα υδροξυκινναμικό οξύ, δηλαδή μία οργανική ένωση που είναι υδρόξυ παράγωγο του κινναμικού οξέος. Το p-κουμαρικό οξύ αποτελεί ένα πολύ σημαντικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των φυτικών κυττάρων και ιδιαίτερα των μονοκοτυλήδονων. Βρίσκεται σε πολλά λαχανικά και φρούτα καθώς επίσης και στη λιγνίνη. Συχνά απαντάται στο κρασί σε εστεροποιημένη μορφή. Το p-κουμαρικό οξύ έχει αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες και έχουν διεξαχθεί διάφορες μελέτες για τις ιδιότητές του αυτές. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε παρασκευή και χαρακτηρισμός του προϊόντος εγκλεισμού του p-κουμαρικού οξέος (trans) σε διμεθυλιωμένη β-κυκλοδεξτρίνη (DIMEB) με σκοπό την αύξηση της υδατοδιαλυτότητας και επομένως της βιοδιαθεσιμότητας του. Το προϊόν εγκλεισμού p-κουμαρικό/DIMEB μελετήθηκε με φασματοσκοπία υπερύθρου και φασματοσκοπία υπεριώδους. Mε τη φασματοσκοπία υπεριώδους παρατηρήθηκε ότι η διαλυτότητα του p-κουμαρικού οξέος αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση της συγκέντρωσης της DIMEB. Η γραμμικότητα του διαγράμματος διαλυτότητας δείχνει τη δημιουργία στο διάλυμα προϊόντος εγκλεισμού στοιχειομετρίας ξενιστή:ξενιζομένου 1:1 του οποίου η σταθερά σύνδεσης ΚS υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Higuchi-Connors και βρέθηκε ίση με 192 Μ-1. Από τη σύγκριση των 4 φασμάτων υπέρυθρης ακτινοβολίας (1. p-κουμαρικό, 2. DIMEB, 3. μείγμα p-κουμαρικού-DIMEB 4. Προϊόν εγκλεισμού p-κουμαρικό/DIMEB) παρατηρούνται περιοχές απορρόφησης ενδεικτικές της αλληλεπίδρασης ξενιζομένου/ξενιστή που αποδεικνύουν το σχηματισμό προϊόντος εγκλεισμού στη στερεά κατάσταση.Επίσης, το p-κουμαρικό/DIMEB κρυσταλλώθηκε και ακολούθησε συλλογή πειραματικών δεδομένων περίθλασης ακτίνων-Χ από τον μονοκρύσταλλο. Προκαταρκτικά αποτελέσματα αυτής της κρυσταλλογραφικής μελέτης παρουσιάζονται σε αυτήν την εργασία. Η δομή του προϊόντος εγκλεισμού p-κουμαρικό/DIMEB προσδιορίστηκε με υπολογιστικές μεθόδους προσομοίωσης σύνδεσης μοριακών μοντέλων (docking). Η πρόβλεψη της βέλτιστης διαμόρφωσης προκύπτει από υπολογισμούς της ελεύθερης ενέργειας Gibbs (ΔG), οι οποίοι οδηγούν σε εκτίμηση της σταθερά σύνδεσης ΚS. Η τιμή της ΚS που προσδιορίστηκε υπολογιστικά (ΚS = 188 M-1) βρίσκεται σε πολύ καλή συμφωνία με την τιμή που προέκυψε από το διάγραμμα διαλυτότητας των φασματοσκοπικών μελετών υπεριώδους. Τέλος, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα του p-κουμαρικού οξέος σε ελεύθερη μορφή συγκριτικά με το προϊόν εγκλεισμού του σε DIMEB με τη δοκιμή FRAP. Τα πειράματα έδειξαν πως η αντιοξειδωτική δράση του p-κουμαρικού οξέος ελαττώνεται παρουσία περίσσειας DIMEB σε σχέση με το p-κουμαρικό οξύ σε ελεύθερη μορφή.

Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides composed of α-(1,4) linked glucopyranoside units and produced from starch by means of enzymatic conversion. Their most interesting property is the formation of inclusion complexes as their hydrophobic cavity and their hydrophilic exterior make them suitable host molecules for a variety of compounds. The complexation with cyclodextrins leads to beneficial modification of the physicochemical properties of the guest molecule like increase of its solubility, slow release and protection from factors like light or oxidation. Therefore, CDs are widely used in food industry, pharmaceuticals, cosmetics, agriculture and chemical engineering. Apart from the natural CDs, numerous modified CDs made by substituting their hydroxyl groups, have been reported. The modified CDs are designed in order to have enhanced and/or selective inclusion properties. Among them, the derivatives of β-cyclodextrin which are formed by the methylation of their 2,6 [Heptakis-(2,6-di-O-methyl)-β-cyclodextrin or DIMEB] and 2,3,6 [Heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl) β-cyclodextrin or TRIMEB] hydroxyl groups are noteworthy. These methylated β-cyclodextrins are commercially available and they have particular interest due to their increased water solubility and their flexible hydrophobic cavity. p-Coumaric acid is a hydroxycinnamic acid, an organic compound that is a hydroxy derivative of cinnamic acid. It is an important cell wall constituent of plants and especially of monocotyledons. It exists in many fruits and vegetables and at lignin as well. Frequently it exists in wine in an esterified form. p-Coumaric acid has been extensively studied for its antioxidant and anti-inflammatory properties. In the present work, the inclusion compound of p-coumaric acid (trans) in DIMEB was formed and characterized. The aim was to increase the water solubility and thus the bio-availability of p-coumaric acid. Using UV-Vis spectroscopy we observed that the solubility of p-coumaric acid increases with the increment of the DIMEB concentration in the solution. The linearity of the phase solubility diagram indicates a complex formation with guest:host stoichiometry of 1:1. The value of the stability constant ΚS was calculated equal to 192 M-1 according to the Higuchi-Connors method. FT-IR spectra were obtained for the lyophilized samples of: 1. p-coumaric, 2. DIMEB, 3. Mixture of p-coumaric and DIMEB and 4. complex of p-coumaric/DIMEB. By comparing these spectra, characteristic absorbance regions indicating the inclusion of p-coumaric and the interaction between the host and the guest molecule were observed verifying the formation of the inclusion compound in the solid state. Additionally, the p-coumaric/DIMEB was crystallized and X-ray diffraction data were collected by exposing the single crystal to synchrotron radiation. Preliminary results of this crystallographic study are presented in this work.Α computational estimation of the most probable 3D structure of p-coumaric/DIMEB complex is given by using the molecular modeling method of docking. The prediction of the optimal conformation results from the Gibbs free energy (ΔG) calculations, which also lead to the evaluation of the stability constant ΚS. The value of ΚS, which was calculated by computational means (ΚS = 188M-1), is in a very good agreement with the value estimated by the experimental phase solubility study. Finally, the effect of the complexation with DIMEB on the antioxidant activity of the p-coumaric acid was studied by using the FRAP assay. The experiments showed a clear decrease of the antioxidant activity of the p-coumaric acid with the presence of an excess of DIMEB. This result indicates a possible H-bond formation (also indicated by molecular modeling calculations) between the proton donor of the p-coumaric acid and one of the DIMEB hydroxyl groups that inhibits the antioxidant activity of the p-coumaric acid.