Καθαρισμός και χαρακτηρισμός των αντιμικροβιακών ουσιών που παράγονται από τα οξυγαλακτικά βακτήρια Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 και Lactobacillus rennini ACA-DC 565

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο καθαρισμός και χαρακτηρισμός των μορίων που ευθύνονται για την αντιμικροβιακή δράση του οξυγαλακτικού βακτηρίου Lactobacillus fermentum ACA-DC 179. Το στέλεχος αυτό έχει απομονωθεί από Κασέρι και παρουσιάζει αντιμικροβιακή δράση έναντι διάφορων οξυγαλακτικών αλλά και παθογόνων βακτηρίων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη του στελέχους σε διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα με στόχο την εύρεση του θρεπτικού υποστρώματος, το οποίο παράγει τη μέγιστη αντιμικροβιακή δράση. Στη συνέχεια εφαρμόσθηκαν τρία διαφορετικά πρωτόκολλα καθαρισμού της αντιμικροβιακής ένωσης που παράγεται από αυτό το στέλεχος. Χρησιμοποιήθηκαν συνδυασμοί κατακρήμνισης με θειικό αμμώνιο με διάφορες μεθόδους χρωματογραφίας και συγκεκριμένα, χρωματογραφίας ανιοντοανταλλαγής, χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης και χρωματογραφίας μοριακής διήθησης. Σε κάθε πρωτόκολλο καθαρισμού έγινε ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών και μέτρηση της αντιμικροβιακής ενεργότητας, ενώ για τον έλεγχο της καθαρότητας της αντιμικροβιακής ουσίας πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών. Μετά την ολοκλήρωση των καθαρισμών πραγματοποιήθηκε ανάλυση Φασματοσκοπίας Μαζών (MS) και MS/MS στο τμήμα Βιοχημείας και Μικροβιολογίας του Πανεπιστημίου Ghent,Βέλγιο, με σκοπό τον προσδιορισμό της Μοριακής Μάζας και την αλληλουχία της αμινοξικής αλληλουχίας. Στο τελικό στάδιο της παρούσας μελέτης πραγματοποιήθηκε συγκαλλιέργεια του παραγωγού με το ευαίσθητο στέλεχος με στόχο να διαπιστωθεί αν το ευαίσθητο στέλεχος επάγει την παραγωγή της αντιμικροβιακής δράσης, το οποίο δεν φάνηκε να συμβαίνει. Συμπερασματικά, προέκυψε ότι η αντιμικροβιακή ένωση που παράγεται από το Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 είναι πιθανό να μην αντιστοιχεί σε βακτηριοσίνη, αλλά σε αντιμικροβιακό πεπτίδιο (BLIP, Bacteriocin Like Peptide).

The aim of the present study was the purification and characterization of a compound which is responsible for the antimicrobial activity of the lactic acid bacterium, Lactobacillus fermentum ACA-DC 179. This strain was isolated from Kasseri cheese and exhibited antimicrobial activity against other lactic acid bacteria, as well as pathogenic bacteria. Firstly, the strain was grown in different growth media in order to determine in which one the highest activity is produced. Afterwards, three different purification protocols were performed. A combination of ammonium sulfate precipitation with various chromatographical methods, namely Anion-exchange Chromatography, Reversed Phase Chromatography and Size exclusion Chromatography was applied. In every protocol the protein concentration and the antimicrobial activity were determined, while electrophoresis was used to control the purity of the antimicrobial compounds. Moreover, tandem mass spectrometric (MS/MS) and mass spectrometric (MS) analyses were carried out in the Department of Biochemistry and Microbiology at Ghent University in Belgium, in order to determine the molecular mass and the amino acid sequence of the antimicrobial compound. In the last section of this study a co-culture of the producer strain with the sensitive strain was performed, in order to investigate if the sensitive strain induces the production of the antimicrobial activity, which was not finally observed. In conclusion, it was found that the antimicrobial compound produced by Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 is probably not a bacteriocin, but it could rather correspond to a Bacteriocin Like Peptide (BLIP).