Μελέτη αντιοξειδωτικής και αντιμικροβιακής δράσης εκχυλισμάτων από τέπαλα κρόκου, φύλλα μελισσόχορτου και πρόπολη

Abstract

Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της βιολογικής και αντιμικροβιακής δράσης αλκοολικών εκχυλισμάτων από τα φαρμακευτικά/ αρωματικά φυτά Crocus sativus L. και Melissa officinalis τα οποία βρίσκονται στην ελληνική χλωρίδα, καθώς και του μελισσοκομικού προϊόντος πρόπολη, επίσης προερχόμενο από την ελληνική φύση. Η παραλαβή των εκχυλισμάτων έγινε για το κάθε δείγμα με διαφορετικό τρόπο. Από τα τέπαλα του κρόκου, στόχος ήταν η απομόνωση και μελέτη των άγλυκων φλαβονοειδών τα οποία αυτά περιέχουν. Πραγματοποιήθηκε υδρόλυση με διάλυμα υδροχλωρικού οξέος συγκέντρωσης 5 Ν και στη συνέχεια εκχύλιση με οξικό αιθυλεστέρα για την παραλαβή των άγλυκων φλαβονοειδών . Από τα φύλλα της Melissa officinalis απομονώθηκαν οι φλαβονοειδείς ενώσεις και τα φαινολικά οξέα. Πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με πετρελαϊκό αιθέρα με χρήση υπερήχων σε υδατόλουτρο για 15 λεπτά και στους 25oC. Το στερεό υπόλειμμα στεγνώνεται με N2 και σε αυτό προστίθεται μεθανόλη HPLC. Επαναλαμβάνεται η διαδικασία στο λουτρό υπερήχων για 15 λεπτά και στους 25oC. Τέλος, όσον αφορά στην πρόπολη, έγινε παρασκευή δύο υδροαλκοολικών εκχυλισμάτων, ένα μεθανολικό και ένα αιθανολικό. Και στα δύο έγινε εκχύλιση με υδροαλκοολικό διάλυμα 70% (v/v) σε αλκοόλη, υποβοηθούμενη από υπερήχους για 15 λεπτά και στους 25oC. Στα εκχυλίσματα προσδιορίστηκε το ολικό φαινολικό περιεχόμενο με τη μέθοδο Folin Ciocalteu, και επιπλέον εκτιμήθηκε η αντιοξειδωτική τους ικανότητα με τις μεθόδους DPPH και ABTS. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ποιοτικός προσδιορισμός των συστατικών των εκχυλισμάτων με την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) και τέλος εκτιμήθηκε η αντιμικροβιακή τους δράση με τη μέθοδο διάχυσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (well diffusion assay), έναντι θετικών και αρνητικών κατά Gram παθογόνων και μη μικροοργανισμών. Τα αποτελέσματα δείχνουν πως τα παραπάνω εκχυλίσματα περιέχουν σημαντική ποσότητα φαινολικών συστατικών με τις τιμές να κυμαίνονται μεταξύ 39,1±0.8 και 5,52±0.09 mg καφεϊκού οξέος/gr φυτικού υλικού. Επιπλέον, τα εκχυλίσματα, παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση η οποία εκτιμήθηκε καλύτερα με τη μέθοδο ABTS. Τα αποτελέσματα εκφρασμένα ως IC50 (Inhibit concentration) κυμαίνονται από 64,24 έως 14,17 μg/mL για τη μέθοδο DPPH ενώ για την ABTS από 24,8 έως 10,15 μg/mL αντίστοιχα. Και στις δύο μεθόδους η Melissa officinalis παρουσιάζει τη χαμηλότερη τιμή IC50 παρόλο που το ολικό φαινολικό περιεχόμενο είναι υψηλότερο στο αιθανολικό εκχύλισμα της πρόπολης. Επιπλέον, αξίζει να αναφερθεί πως τα τέπαλα του κρόκου τα οποία παραμένουν ανεκμετάλλευτα, παρουσίασαν αξιόλογη αντιοξειδωτική δράση, συγκρίσιμη με αυτή της Melissa officinalis, όσον αφορά στη μέθοδο ABTS. Η ανάλυση των εκχυλισμάτων με την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης έδειξε πως η καμφερόλη είναι το κυρίαρχο φλαβονοειδές στα τέπαλα του Crocus sativus L. και το ροσμαρινικό οξύ αποτελεί το κυριότερο φαινολικό οξύ στη Melissa officinalis. Όσον αφορά και στα δύο εκχυλίσματα της πρόπολης, η κύρια κορυφή η οποία εμφανίζεται στα αντίστοιχα χρωματογραφήματα δεν ανιχνεύτηκε με βάση της διαθέσιμες πρότυπες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν. Πιθανώς όμως να πρόκειται για την πινοσεμπρίνη (pinocembrin), η οποία αποτελεί το φλαβονοειδές με τη μεγαλύτερη αναλογία σύμφωνα με τη μελέτη των Kalogeropoulos et al., 2009, οι οποίοι ανάλυσαν δείγμα πρόπολης προερχόμενο από την ίδια γεωγραφική περιοχή. Από τις μικρότερες κορυφές που μπόρεσαν να ανιχνευτούν, σε μεγαλύτερο ποσοστό βρίσκεται το καφεϊκό οξύ και για τα δύο εκχυλίσματα. Τέλος, η μελέτη της αντιμικροβιακής δράσης των εκχυλισμάτων παρουσιάζει ικανοποιητικά αποτελέσματα. Επιπλέον των ήδη έτοιμων εκχυλισμάτων, έγινε παραλαβή τεπάλων Crocus sativus L., νέας σοδιάς και μελετήθηκε η αντιμικροβιακή δράση. Από τα βακτήρια που εξετάστηκαν, οι πιο ανθεκτικοί φαίνεται να είναι οι κατά Gram αρνητικοί μικροοργανισμοί, ιδιαίτερα απέναντι στα εκχυλίσματα της πρόπολης και του μελισσόχορτου. Είναι εντυπωσιακή η δράση που παρουσίασαν τα τέπαλα του Crocus sativus L σοδιάς 2013, τα οποία παρεμπόδισαν όλους τους μικροοργανισμούς που μελετήθηκαν με ελάχιστη συγκέντρωση παρεμπόδισης (MIC) 50 mg/mL για την πλειοψηφία των μικροοργανισμών και για στελέχη στα οποία η δράση των υπολοίπων εκχυλισμάτων ήταν ανενεργή. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει επίσης ότι αποθηκευμένα σε κατάλληλες συνθήκες, τα τέπαλα εκτός από το χρώμα, διατηρούν τις βιολογικές τους ιδιότητες. Όσον αφορά στο εκχύλισμα της Melissa officinalis η MIC για το μεγαλύτερο μέρος των μικροοργανισμών ήταν 200 mg/mL, ενώ η δράση της στα στελέχη της Salmonella ήταν ανενεργή. Παρόμοια εικόνα εμφανίζεται και για τα δυο εκχυλίσματα της πρόπολης, με τα στελέχη της Salmonella να είναι πιο ανθεκτικά σε σχέση με τους υπόλοιπους μικροοργανισμούς.

The aim of this thesis was to study the biological and antimicrobial activity of alcoholic extracts of the following medicinal/ aromatic plants: Crocus sativus L. and Melissa officinalis which are found at the Mediterranean flora, as well as the activity of propolis, also derived from Greek nature. The preparation of the extracts was done differently regarding the three samples. From tepals of Crocus sativus L., the aim was to isolate and study the aglycon part of flavonoids which they contain. Tepals were hydrolised with acid chloride 5N of concentration and then were extracted with ethyl ester in order to segregate the aglycone part of flavonoids. From leaves of Melissa officinalis were segregated flavonoids and phenolic acids. Leaves, were first extracted with petroleum ether by using ultrasounds water bath for 15 minutes at 25oC. Then the solid residue became dry with nitrogen steam and then methanol (HPLC) was added. The sample was placed in ultrasounds water bath for 15 minutes at 25oC. Finally as far as propolis is concerned, a hydromethanolic and a hydroethanolic extracts were prepared. Both were extracted with hydroalcoholic solution 70% (v/v) by using ultrasonic bath for 15 minutes at 25oC. The content of total phenolic compounds in plant extracts was determined by Folin Ciocalteu method, while their antioxidant activity was estimated with DPPH and ABTS method. Subsequently the qualitative analysis of the compounds of the extracts was defined by using high performance liquid chromatography technique (HPLC). Finally, the antimicrobial activity of the extracts was determined using well diffusion assay method, (WDA), against Gram positive and Gram negative micro organisms. The results of the study, indicate that all extracts are rich in phenolic compounds with their values ranging from 39,1± 08 και 5,52±0.09 mg caffeic acid/ g extract. Moreover it is noteworthy to mention that their antioxidant activity was better estimated with the ABTS method. The results expressed as IC50 (Inhibit concentration) are ranging from 64.27 to 14.17 μg/mL as far as DPPH method is concerned while for the ABTS method ranges from 24.8 to 10.15 μg/mL. Furthermore, Melissa officinalis has the lowest value of IC50 in both methods, despite the fact that total phenolic content is higher at the methanolic extract of propolis. In addition it is noteworthy that tepals of Crocus sativus L. that still remain unexploited, present a notable antioxidant activity comparable to that of Melissa officinalis as far as ABTS method is concerned. The analysis of the extracts by using the HPLC method showed that kaempherol is the main flavonoid compound of Crocus sativus L tepals and rosmarinic acid the main phenolic acid of Melissa officinalis. Regarding both propolis extracts, the major peak that appears at the chromatograph was not identified using the available standard solutions. However it is probably pinocembrin. According to Kalogeropoulos et al., 2009, which also studied propolis from the same geographical region, pinocembrin is the flavonoid present in greater proportion. From the smaller peaks that were identified, we can deduce that caffeic acid is in abundance in both propolis extracts. Last but not least, the study of the antimicrobial activity of the extracts shows satisfactory results. In addition to the already prepared extracts, new crop of Crocus sativus L. tepals was received and it was tested for its antimicrobial activity. Most resistant from the bacteria tested, appeared to be Gram negative micro organisms, particularly towards the extracts of propolis and Melissa officinalis. It is remarkable however the inhibition produced by tepals, crop 2013, which inhibited all micro organisms tested with a minimum inhibition concentration (MIC) 50 mg/mL for the majority of micro organisms and stains in which the activity of the remaining extracts was inactive. This also demonstrates that stored under appropriate conditions, tepals except for their colour, retain their biological activities. As to the extract of Melissa officinalis the MIC for the majority of the micro organisms was 200 mg/mL, while their activity on most strains of Salmonella was inactive. The same applies also for the two extracts of propolis with the strains of Salmonella being more resistant compared with other micro organisms.