Κλωνοποίηση βακτηριοσινών του Streptococcus macedonicus ACA - DC 198 σε βακτήρια Escherichia coli, Lactococcus lactis και Streptococcus thermophilus

Abstract

Ο Streptococcus macedonicus απομονώθηκε για πρώτη φορά από Ελληνικό Κασσέρι. Είναι οξυγαλακτικό βακτήριο, ανήκει στο σύμπλεγμα των μικροοργανισμών Streptococcus bovis/ Streptococcus equinus και φαίνεται να έχει χάσει κάποια στοιχεία της παθογένειάς του εξελικτικά. Το στέλεχος S. macedonicus ACA-DC 198 παρουσιάζει τεχνολογικό ενδιαφέρον καθώς παράγει αντιμικροβιακά πεπτίδια τις βακτηριοσίνες. Οι βακτηριοσίνες ανάλογα με την κλάση στην οποία ανήκουν λειτουργούν με διαφορετικούς τρόπους στην αναστολή της ανάπτυξης βλαστικών μορφών και σπορίων βακτηρίων. Η μασεδοσίνη και η μασεδοβισίνη του S. macedonicus εκδηλώνουν αντιμικροβιακή δράση έναντι άλλων Gram θετικών βακτηρίων, όπως οξυγαλακτικά, αλλοιωγόνα και παθογόνα βακτήρια. Η ανάλυση του γονιδιώματός του έδωσε ενδείξεις για την ύπαρξη τριών νέων πιθανών βακτηριοσινών. Σκοπός της μελέτης ήταν η κλωνοποίηση των νέων βακτηριοσινών σε κύτταρα Escherichia coli, Lactococcus lactis και Streptococcus thermophilus. Για το λόγο αυτό, από το φορέα κλωνοποίησης pORI198 δημιουργήθηκε ο παλίνδρομος φορέας που έφερε τμήμα DNA για τις νέες τρεις βακτηριοσίνες. Ο παλίνδρομος φορέας κλωνοποίησης χρησίμευε στην ένθεση του DNA για τις νέες τρεις βακτηριοσίνες σε κύτταρα E. coli, L. lactis και S. thermophilus. Στη μελέτη αναλύονται οι μέθοδοι και οι νέες τεχνικές που εφαρμόστηκαν για την κλωνοποίηση. Ακόμα περιγράφεται ο έλεγχος για την ετερόλογη έκφραση των νέων βακτηριοσινών μέσω της αναστολής πιθανών ευαίσθητων στελεχών. Τα αποτέλεσματα της μελέτης περιλαμβάνουν την επιτυχή κλωνοποίηση των τριών νέων βακτηριοσινών σε κύτταρα E. coli και L. lactis και την ανάπτυξη νέας διαδικασίας για την κλωνοποίηση στον S. thermophilus. Ο έλεγχος για την ετερόλογη έκφραση των νέων βακτηριοσινών δεν έδωσε θετικά αποτελέσματα ακόμα και όταν χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της συμπύκνωσης. Απαιτείται περαιτέρω έλεγχος της ετερόλογης έκφρασης των νέων βακτηριοσινών με την αλυσιδωτή αντίδραση της ανάστροφης τρανσκριπτάσης. Η αντίδραση αυτή θα συμβάλει στον καθορισμό του αντιμικροβιακού φάσματος των νέων βακτηριοσινών.

Streptococcus macedonicus had been isolated for the first time from the Greek cheese Kasseri. It is a lactic acid bacterium that belongs to Streptococcus bovis/Streptococcus equinus complex. It seems to have lost evolutionary elements of its pathogenicity. Strain S. macedonicus ACA-DC 198 presents technological interest because it produces antimicrobial peptides, bacteriocins. Bacteriocins act in different ways -according to the class they belong to- in order to inhibit the growth of stem and spore forms of bacteria. Macedocin and macedovicin, the known bacteriocins produced by S. macedonicus, exhibit antimicrobial activity against other Gram positive bacteria, such as lactic acid bacteria, as well as several food spoilage and pathogenic bacteria. The analysis of its genome has shown the existence of three new potential bacteriocins. The purpose of the study was to clone the new bacteriocins in bacteria cells of Escherichia coli, Lactococcus lactis and Streptococcus thermophilus. Therefore, shuttle cloning vector bearing DNA fragment of three new bacteriocins had been created from cloning vector pORI198. Shuttle vector was used to insert DNA fragment into E. coli, L. lactis and S. thermophilus cells. The study analyzes the cloning methods and new techniques that have been applied to. Also, the heterologous expression of the new bacteriocins through inhibition of putative sensitive strains is described. The study results include the successful cloning of the three new bacteriocins into E. coli and L. lactis cells and the development of a new process for cloning into S. thermophilus. Monitoring for the heterologous expression of the new bacteriocins gave no positive results even when the bacteriocins were condensated. Further control of the heterologous expression of the new bacteriocins by polymerase chain reaction of reverse transcriptase is needed. This control will help determine the antimicrobial spectrum of the three new bacteriocins.