Αξιοποίηση βιομηχανικών παραπροϊόντων προς παραγωγή φουμαρικού οξέος

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της μορφολογίας του μύκητα Rhizopus arrhizus NRRL 2582 στην παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας κατά την υγρή καλλιέργειά του σε υπόστρωμα γλυκόζης παρουσία εμπορικών πηγών αζώτου. Τα πειράματα στόχευσαν στην δημιουργία δύο διαφορετικών μορφολογιών εκείνης των συνεκτικών σφαιριδίων βιομάζας (pellets) και του ομοιόμορφα διάσπαρτου μυκηλίου (dispersed mycelia). Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής ενζυμικά υδρολυμένου σογιάλευρου και η αξιοποίησή του, ως πηγή αζώτου και ιχνοστοιχείων στις μικροβιακές ζυμώσεις. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση της βιομάζας σε μορφή σφαιριδίων, του μύκητα Rhizopus arrhizus NRRL 2582, σε 25 g/L αρχική συγκέντρωση γλυκόζης. Η διάρκεια επώασης του εμβολίου της προκαλλιέργειας ήταν 7 και 24 ώρες. Στο μέσο της ζύμωσης προστέθηκαν, θειϊκό αμμώνιο σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (0.2 και 0.04 g/L) και ανθρακικό ασβέστιο ως παράγοντας ρύθμισης του pH και παραγωγής φουμαρικού οξέος. Διαπιστώθηκε ότι οι καλύτερες συνθήκες για την βιοτεχνολογική παραγωγή φουμαρικού οξέος με τη χρήση βιομάζας υπό μορφή σφαιριδίων, ήταν η προκαλλιέργεια με διάρκεια επώασης 24 ωρών σε συνδυασμό με αρχική συγκέντρωση 0.2 g/L θειϊκού αμμωνίου. Σε αυτές τις συνθήκες παράχθηκαν 14.7 g/L φουμαρικού οξέος, η απόδοση ήταν 0.6 g φουμαρικού οξέος ανά g συνολικών σακχάρων και η παραγωγικότητα του μύκητα ανήλθε στα 0.2 g/L/h. Στη συνέχεια των πειραμάτων, μελετήθηκε η επίδραση της μορφολογίας αυτή τη φορά με το σχηματισμό διάσπαρτου μυκηλίου του μύκητα Rhizopus arrhizus NRRL 2582 για την παραγωγή φουμαρικού οξέος. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης, του υποστρώματος 25 και 50 g/L γλυκόζης και του θειϊκού αμμωνίου (0.2 και 0.04 g/L), στο υγρό θρεπτικό μέσο της κύριας καλλιέργειας. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση φουμαρικού οξέος (30.1 g/L) επιτεύχθηκε όταν η αρχική συγκέντρωση της γλυκόζης ήταν 50 g/L και 0.04 g/L θειϊκό αμμώνιο. Η μεγαλύτερη απόδοση της παρούσας μελέτης (0.84 g/g) επιτεύχθηκε με την ίδια αρχική συγκέντρωση θειϊκού αμμωνίου (0.04 g/L) ενώ η αρχική συγκεντρωση γλυκόζης ήταν 25 g/L στο υγρό της ζύμωσης. Η μεγαλύτερη παραγωγικότητα της εργασίας ήταν 0.27 g/L/h με αρχική συγκέντρωση 25 g/L γλυκόζης και 0.2 g/L θειϊκό αμμώνιο. Όσον αφορά στα μορφολογικά χαρακτηριστικά της βιομάζας τα καλύτερα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν όταν ο αριθμός των κυττάρων ήταν μεγαλύτερο από 104 κύτταρα και η μέση διάμετρος αυτών ήταν 0.5 mm ανεξάρτητα από τη σύσταση της προκαλλιέργειας. Στο επόμενο πειραματικό στάδιο πραγματοποιήθηκε υδρόλυση του σογιαλεύρου με τη χρήση των πρωτεολυτικών ενζύμων που παρήχθησαν από το μύκητα Aspergillus oryzae κατά την καλλιέργεια του σε υπόστρωμα στερεής κατάστασης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, ο καλύτερος χρόνος επώασης για την παραγωγή πρωτεολυτικών ενζύμων (197.63 U/g) του εν λόγου μύκητα, ήταν οι 70 ώρες ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία υδρόλυσης ήταν οι 45 οC. Υπό αυτές τις συνθήκες, η μέγιστη παραγωγή αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων αμινοξέων κι πεπτιδίων (Free Amino Nitrogen ή FAN) που επιτεύχθηκε ήταν 1363 mg/L και του ανόργανου φωσφόρου (Inorganic Phosphorus ή IP) ήταν 105 mg/L στο υδρόλυμα μετά από 48 ώρες. Τέλος, μελετήθηκε η αντικατάσταση των εμπορικών πηγών αζώτου της προκαλλιέργειας (στην περίπτωση που παράγεται διάσπαρτο μυκήλιο) με το υδρόλυμα σογιαλεύρου σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις, 200 και 400 mg/L FAN. Η μεγαλύτερη συγκεντρωση φουμαρικού οξέος (33 g/L) και η μεγαλύτερη απόδοση (0.69 g/g) επιτεύχθηκαν όταν το αρχικό FAN της προκαλλιέργειας ήταν 200 mg/L. Η μεγαλύτερη παραγωγικότητα που επιτεύχθηκε ήταν 0.22 g/L/h όταν στην προκαλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε αρχική συγκέντρωση FAN ίση με 400 mg/L ως πηγή αζώτου.

The aim of the present thesis was to study the effect of fungal morphology of Rhizopus arrhizus NRRL 2582 in order to produce high added value chemicals (platform chemicals) using glucose as carbon source and commercial nitrogen sources. The impact of two different cell morphologies - pellets and dispersed mycelia - on fumaric acid production was evaluated. Moreover, the production and utilization of enzymatic soybean meal hydrolysate as nitrogen source in the preculture broth was assessed. Fumaric acid production was initially studies by using pellets of the fungal strain R. arrhizus NRRL 2582 at an initial concentration of 25 g/L glucose. The preculture used as inoculum was incubated for 7 and 24 hours. The fermentation medium contained ammonium sulfate at two different concentrations (0.2 and 0.04 g/L) and calcium carbonate as neutralizing agent and for induction of succinic acid production. The results indicate that the best conditions for the biotechnological production of fumaric acid was observed when the inoculum was incubated for 24 hours in combination with an initial concentration of 0.2 g/L ammonium sulfate. The fumaric acid concentration produced was 14.7 g/L, the yield achieved was 0.6 g fumaric acid per g total sugars and the productivity was 0.2 g/L/h. The effect of dispersed mycelia of fungal strain R. arrhizus NRRL 2582 for the production of fumaric acid was also assessed. In particular, the effect of initial concentrations of glucose (25 and 50 g/L) and ammonium sulfate (0.2 and 0.04 g/L) was evaluated. The highest concentration of fumaric acid (30.1 g/L) produced by using commercial nitrogen sources was achieved at 50 g/L of intial glucose concentration and 0.04 g/L of initial ammonium sulfate concentration. The highest yield (0.84 g/g) was achieved at 0.04 g/L of initial ammonium sulfate concentration and 25 g/L of initial glucose concentration. The highest productivity (0.27 g/L/h) was achieved at an initial glucose concentration of 25 g/L and an initial ammonium sulfate concentration of 0.2 g/L. Regarding the morphological characteristics of fungal biomass, the best results were achieved when the number of cells was higher than 104 and the average diameter thereof was 0.5 mm, regardless the nutrient composition of the preculture medium. Hydrolysis of soybean meal using proteolytic enzymes was achieved after production of the enzymes via solid state fermentation using the fungal strain Aspergillus oryzae. Results showed that the incubation time leading to the highest production of proteolytic enzymes (197.63 U/g) was 70 hours and the optimal hydrolysis temperature was 45 °C, producing a fermentation nutrient supplement rich in free amino nitrogen (FAN) and inorganic phosphorus (IP). The highest concentrations achieved were 1363 mg/L FAN and 105 mg/L IP at 48 hours. It was also investigated the potential of utilize the soybean meal hydrolysate as nitrogen source in order to substitute the commercial nitrogen sources in the preculture medium. Two different FAN concentrations were used, 200 and 400 mg/L FAN, in dispersed mycelia preculture. The highest concentration of fumaric acid (33 g/L) and the highest yield (0.69 g/g) were achieved when the FAN concentration in the preculture medium was 200 mg/L. The highest productivity (0.22 g/L/h) was achieved when a FAN concentration of 400 mg/L was used in the preculture medium.