Βιοχημική και μοριακή ανάλυση της βακτηριοφερριτίνης του Azotobacter vinelandii

Abstract

Οι φερριτίνες είναι μια υπεροικογένεια πρωτεϊνών αποθήκευσης σιδήρου, εξαπλωμένη σε όλους τους αναερόβιους και αερόβιους ζωντανούς οργανισμούς. Φερριτίνες που απομονώθηκαν από βακτήρια, μπορεί να περιέχουν αίμη ή όχι. Στην πρώτη περίπτωση, λέγονται βακτηριοφερριτίνες. Πρωταρχικός ρόλος των φερριτινών στα κύτταρα είναι να αποθηκεύουν το σίδηρο σε μορφή Fe3+. Ένας δευτερεύοντας ρόλος τους είναι η αποτοξίνωση από το σίδηρο ή να προστατεύουν το κύτταρο από το Ο2 και τις ελεύθερες ενεργές ρίζες του. Φερριτίνες και βακτηριοφερριτίνες έχουν παρόμοια δομή. Ένα 24-μερές σύμπλοκο σχηματίζει ένα σφαιρικό περίπου κέλυφος. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης κλωνοποιημένου γονιδίου της βακτηριοφερριτίνης του Azotobacter vinelandii, στελέχη AvOP-2916 και AvOP-5614. Τα γονίδια υποκλωνοποιήθηκαν στον φορέα έκφρασης pET28a(+) και αφού ολοκληρώθηκε η αλληλούχισή τους χαρακτηρίστηκαν ως cDNA κλώνοι της φερριτίνης. Εν συνεχεία εκφράστηκαν ετερόλογα σε κύτταρα Εscherichia coli BL21 (DE3) και εξετάστηκε το επίπεδο έκφρασης στο διαλυτό και αδιάλυτο κλάσμα της ανασυνδυασμένης βακτηριοφερριτίνης σε πηκτή SDS - πολυακρυλαμίδης.

Ferritins constitute a broad superfamily of iron storage proteins, widespread in all domains of life, in aerobic or anaerobic organisms. Ferritins isolated from bacteria may contain a haem or be haem-free. In the first case they are called bacterioferritins. The primary function of ferritins inside cells is to store iron in the ferric form. A secondary function may be detoxification of iron or protection against O2 and its radical products. Ferritins and bacteroferritins have essentially the same architecture, assembling in a 24mer cluster to form a hollow, roughly spherical construction. The aim of this study was to overexpress and characterize a gene encoding for bacterioferritin in nitrogen-fixing bacterium Azotobacter vinelandii strains: AvOP-2916 and AvOP-5614. These genes were subcloned into the expression vector pET28a (+) and after completion of their sequencing, they characterized as cDNA clones of ferritin. Subsequently, they expressed heterologous in Escherichia coli cells BL21 (DE3) and the expression level was examined in the soluble and insoluble fraction of the recombinant bacterioferritin in SDS-polyacrylamide gel.