Διερεύνηση της ικανότητας μάθησης του Ευρωπαϊκού λαβρακιού (Dicentrarchus labrax) και της έκφρασης σχετικών γονιδίων του εγκεφάλου

Abstract

Η ευζωία, αφορά την εξασφάλιση της καλής ποιότητας ζωής των ζώων και προϋποθέτει την ύπαρξη γνωστικών ικανοτήτων που επιτρέπουν την αξιολόγηση της. Τα περισσότερα σπονδυλωτά διαθέτουν γνωστικές ικανότητες και το ίδιο έχει αποδειχτεί τα τελευταία χρόνια για τους ιχθύς. Η μάθηση, συντελείται στον εγκέφαλο των σπονδυλωτών, αποτελεί βασική γνωστική ικανότητα και αφορά μια μόνιμη αλλαγή των δεξιοτήτων ή της εκδήλωσης συγκεκριμένης συμπεριφοράς που προκύπτει από την εμπειρία. Οι ιχθύς διαφέρουν ως προς τον σχηματισμό του εγκεφάλου τους καθώς στερούνται νεοφλοιό και μεταιχμιακό σύστημα (ιππόκαμπος, αμυγδαλή), περιοχές του εγκεφάλου θηλαστικών που εμπλέκονται στη μάθηση και τη μνήμη. Παρόλα αυτά έχουν παρατηρηθεί ομόλογα τμήματα του εγκεφάλου τους και συγκεκριμένα του πρόσθιου τμήματος που καλείται τελεγκέφαλος με τον ιππόκαμπο και την αμυγδαλή. Η συνειρμική μάθηση, η μνήμη, η πλοήγηση, ο προσανατολισμός, η συνεργασία, η διάθεση αναπαραγωγής, η «επικοινωνία» θεωρούνται ικανότητες των ιχθύων στις οποίες εμπλέκεται ο ρόλος του τελεγκεφάλου. Σε μοριακό επίπεδο οι παραπάνω ικανότητες και εξελικτικές προσαρμογές συντελούνται βάσει της έκφρασης γονιδίων. Μια συγκεκριμένη κατηγορία γονιδίων που προτείνεται ότι εμπλέκεται στην αντίδραση σε ερεθίσματα του περιβάλλοντος, ως η «πρώτη γραμμή» έκφρασης, είναι τα πρώιμης έκφρασης γονίδια (Immediate early genes).Τα γονίδια αυτά έχουν παρατηρηθεί στον εγκέφαλο θηλαστικών, στην περιοχή του ιππόκαμπου της αμυγδαλής, αλλά και στους εγκεφάλους πτηνών, ερπετών, τρωκτικών και ιχθύων. Στην παρούσα μελέτη έγινε διερεύνηση της ικανότητας μάθησης 92 ατόμων ευρωπαϊκού λαβρακιού σε κατάλληλα διαμορφωμένο λαβύρινθο και ποσοτικοποιήθηκε, με χρήση ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR), η έκφραση 2 γονιδίων πρώιμης έκφρασης, egr-1 και c-fos που εμπλέκονται στη χωρική μάθηση, στη μνήμη και σε άλλες λειτουργίες. Έγιναν 2 εκπαιδεύσεις μια 8ήμερη και μια 3ήμερη, με 3 δοκιμές ανά ημέρα και χρησιμοποιήθηκε ως οπτικό ερέθισμα ένα λευκό σημάδι που οδηγούσε το άτομο προς εξέταση στο σωστό θάλαμο του λαβυρίνθου. Σαν επιβράβευση (θετική ενίσχυση) σε κάθε επιτυχημένη δοκιμή, χορηγήθηκε στο άτομο τροφή ενώ υπήρχε και ομοειδές άτομο πίσω από διαφανές τοίχωμα. Τα άτομα που εξετάστηκαν διαχωρίστηκαν σε 3 κατηγορίες: Τα άτομα που τηρούσαν το κριτήριο επιτυχίας (Μ) και έμαθαν, τα άτομα που δεν έκαναν καμία επιτυχημένη προσπάθεια (ΔΜ) και τα άτομα που παρόλο που έκαναν επιτυχημένες προσπάθειες δεν τηρούσαν το κριτήριο επιτυχίας (Μ?). Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων egr-1 και c-fos έγινε για τα άτομα Μ και ΔΜ. Τα άτομα Μ της 8ήμερης εκπαίδευσης, έμαθαν μετά από 8-9 δοκιμές και είχαν μέσο χρόνος επιτυχημένης εισόδου 12 λεπτά που αποτελούσε και τον μικρότερο χρόνο από τα άτομα Μ? και ΔΜ. Τα 3 άτομα Μ της 3ήμερης εκπαίδευσης έμαθαν μετά από 4-6 δοκιμές και είχαν μέσο χρόνο επιτυχημένης εισόδου ~17 λεπτά. Την τελευταία ημέρα (ημέρα δειγματοληψίας) τα άτομα Μ είχαν τους καλύτερους χρόνους συγκριτικά με τους ΔΜ και Μ? και για τις 2 περιόδους εκπαίδευσης. Η σχετική έκφραση των egr-1 και c-fos ήταν σημαντικά αυξημένη στα Μ συγκριτικά με τα ΔΜ και στις 2 περιόδους εκπαίδευσης. Η ανάλυση παραλλακτικότητας έδειξε ότι η σχετική έκφραση και των 2 γονιδίων των ατόμων Μ ήταν μεγαλύτερη στον τελεγκέφαλο στην συνέχεια στον υποθάλαμο – υπόφυση και τέλος στον λοιπό εγκέφαλο. Κατά την 8ήμερη εκπαίδευση η έκφραση του c-fos στον τελεγκέφαλο ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα άτομα Μ συγκριτικά με τα ΔΜ ενώ κατά την 3ήμερη εκπαίδευση τόσο η έκφραση των c-fos και egr-1 στον τελεγκέφαλο ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα άτομα Μ συγκριτικά με τα άτομα ΔΜ. Παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ των 2 γονιδίων, ισχυρότερη στον τελεγκέφαλο. Οι αρνητικές συσχετίσεις, μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων και του μέσου χρόνου επιτυχίας αλλά και του μέσου χρόνου δοκιμών, που παρατηρήθηκαν την τελευταία ημέρα υποδηλώνουν την εμπλοκή των γονιδίων αυτών στην διαδικασία μάθησης.

The term “welfare” stands for animals’ good quality of life. The evaluation of welfare demands cognitive abilities which most vertebrates possess. The same applies for fish. Learning takes place in the brain and is a cognitive ability for permanent changes as well as behavioural responses that emerge from experience. Learning and memory evolve in the regions of the mammalian brain called neocortex and limbic system hippocampus, amygdala. Although fish brain differs morphologically from other vertebrates lacking neocortex and limbic system, there are homologies between those regions and the forebrain area of telencephalon. The latter is involved in cognitive processes such as associate learning, memory, imprinting, navigation, cooperation, reproduction and social behaviour. At the molecular level, the above mentioned skills and evolutionary adaptations occur in the basis of the expression of several genes. As a response to environmental stimuli there is a particular group of genes called immediate early genes (IEGs) which have been observed to be expressed in the brain of birds, reptiles, rodents and fish as well as in the areas of hippocampus and amygdala of the mammalian brain. In this study, 92 speciments of European seabass were trained in a maze as an investigation of their learning ability. The expression of two specific IEGs, egr-1 and c-fos which are involved in the processes of learning and memory was measured with real time quantative polymerase chain reaction (qPCR). There were two training sessions (an 8-day and a 3-day) with 3 trials per day using a white visual cue as an optical stimulus for each specimen individually, indicating the correct chamber of the maze. When the specimen entered the correct chamber of the maze, a congener was seen through a transparent wall and food was delivered as a reward. The fish tested were categorized in 3 distinct groups according to their performance, the first which learned the task (L), the second which never succeeded (NL) and the third which made a few correct entrances but with no repetition (L?). Specimens belonging to L and NL groups were analyzed for egr-1 and c-fos expression. During the 8-day training session, the group L differed from L? and NL as it had an average time of 12 minutes for the correct entry after 8-9 trials. The same group learned after 4-6 trials having an average time of ~17 minutes during the 3-day training session meeting the learning criteria. Overall, in the last day (day of sampling) the group L had the best times in comparison with the other two (L? and NL). In addition, the expression of egr-1 and c-fos was significantly higher in the L group compared to the NL group. ANOVA analysis showed the highest expression of the L group in the telencephalon, second higher in the hypothalamus-pituitary gland and third higher in the rest of the brain. In the 8-day training session the expression of c-fos in the telencephalon was 5 statistically higher in the L group than the NL group. In the 3-day session the expression of both genes in the telencephalon was significantly higher in the L group than the NL. There was a positive correlation between the expression of the two genes, stronger in the telencephalon. Finally, the negative correlations between the expression of both genes and the average time of correct entries and the average time of trials in the last day, indicate the involvement of both genes in the learning process.