Αξιολόγηση αναλόγων γλουταθειόνης ως υποστρωμάτων και αναστολέων της Τρανσφεράσης Γλουταθειόνης Ρ1-1

Abstract

Οι τρανσφεράσες γλουταθειόνης (GSTs) συνθέτουν μια πολυγονιδιακή οικογένεια ισοεν-ζύμων που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αποτοξίνωση, καθώς και στο μεταβολισμό των ξενοβιοτικών ενώσεων σε πληθώρα οργανισμών και ιδίως του ανθρώπου, στον οποίο εστιάζει η παρούσα μελέτη. Τα συγκεκριμένα ένζυμα εκφράζονται τόσο σε υγιείς όσο και σε ασθενείς ι-στούς. Στον άνθρωπο διακρίνονται σε επτά τάξεις κυτταροπλασματικών ισοενζύμων, από τις οποίες οι συνηθέστερα εκφραζόμενες σε περιπτώσεις καρκίνου είναι οι α, μ και π. Η από τη φύ-ση τους δράση συνδέεται και με την εμφάνιση ανθεκτικότητας των καρκινικών κυττάρων στην χορήγηση μεγάλου εύρους αντικαρκινικών σκευασμάτων, λόγω της εξουδετέρωσής τους μέσω της σύζευξης με το άφθονο τριπεπτίδιο της γλουταθειόνης (GSH). Άμεση συνέπεια αυτών είναι η μειωμένη αποτελεσματικότητα της θεραπευτικής αγωγής. Πολλή και ενδελεχής έρευνα πραγ-ματοποιείται στην προσπάθεια εύρεσης νέων φαρμακευτικών ενώσεων ικανών να αναστέλλουν τη λειτουργία των εν λόγω ενζύμων. Για το σκοπό αυτό, συντέθηκαν τριπεπτιδικά ανάλογα της γλουταθειόνης με στόχο την αξιολόγησή τους ως προς την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν τη δράση των ενζύμων ή να αποτελούν υποστρώματα αυτών. Αρχικά, προχωρήσαμε σε υποκλωνοποίηση των ανθρώπινων αλλοενζύμων της π τάξης (hGSTP1*A, hGSTP1*B και hGSTP1*C) σε πλασμιδιακό φορέα για ετε-ρόλογη έκφραση σε βακτήρια Εscherichia coli, στον καθαρισμό τους και στη μελέτη τους έναντι των τριπεπτιδικών ενώσεων. Η επιλογή των συγκεκριμένων αλλοενζύμων έγινε με γνώμονα τα υψηλά επίπεδα έκφρασης που παρατηρούνται σε περιπτώσεις καρκίνου. Τα πεπτιδικά ανάλογα της γλουταθειόνης που συντέθηκαν αριθμούνται με λατινικούς χαρακτήρες σε είκοσι πέντε και είναι χωρισμένα σε τέσσερις ομάδες (Α, Β, Γ, Δ) με αλλαγές στο πρώτο αμινοξύ (Α), στο δεύτερο (Β), στο τρίτο (Γ) και σε περισσότερα από ένα αμινοξέα (Δ). Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής έδειξαν ότι υπάρχει μερική εξειδίκευση ως προς την ανασταλτική δράση του πεπτιδικού αναλόγου ΙΧ (γ-Glu-Thi-Gly) για τα αλλοένζυμα hGSTP1*A & hGSTP1*C και του πεπτιδικού αναλόγου ΧΙ (γ-Glu-Cys(Acm)-Gly) για τα αλλοένζυμα hGSTP1*B & hGSTP1*C, χωρίς να παρατηρείται αξιόλογη ενζυμική αναστολή από τα υπόλοιπα ανάλογα. Επιπλέον, υποστρωματική δράση εμφάνισαν πεπτίδια από τις ομάδες Α και Γ, με ση-μαντικότερα τα πεπτίδια ΙΙ (Tic-Cys-Gly) και IV (Hyp-Cys-Gly) της ομάδας Α, που σημείωσαν καλή δραστικότητα για το αλλοένζυμο hGSTP1*A (41,3% και 39,3% FA αντίστοιχα) και το πε-πτίδιο XV (γ-Glu-Cys-Sar) της ομάδας Γ, που έδειξε σημαντική δραστικότητα και για τα τρία μελετώμενα αλλοένζυμα (17%, 60,8% και 67,7% FA για τα hGSTP1*A, hGSTP1*B και hGSTP1*C αντίστοιχα).

Glutathione transferases (GSTs) constitute a multigene superfamily of isozymes which play a crucial role in cell detoxification as well as in metabolism of xenobiotic compounds in a wide range of organisms, especially humans where upon the current project lies. These enzymes are expressed in normal and unhealthy tissues. Human cytosolic GSTs are divided in seven major classes. Among them, the most frequently expressed in cancer cells belong to classes α, μ and π. The ability of catalyzing the nucleophilic addition of the tripeptide glutathione (GSH) to a variety of chemicals bearing electrophilic functional centres is correlated with the phenomenon of multi-drug resistance (MDR) towards numerous anticancer drugs. Consequently, there has been a notable reduction in the efficacy of the anticancer therapeutic protocols. Therefore, assiduous research takes place in order to find new pharmaceutical compounds effective in inhibiting the MDR-responsible enzymes. For that purpose, synthetic tripeptide GSH-analogues were designed and synthesized with the aim of evaluating their ability to act as inhibitors or substrates of glutathione trans-ferases. The experimental procedure included subcloning of three human allozymes of π class (hGSTP1*A, hGSTP1*B, hGSTP1*C) in a plasmid vector specific for overexpression in Esche-richia coli, enzyme purification, and evaluation of the peptide analogues with the three human GSTP1 allozymes. These allozymes were selected for the increased expression levels in tumor cells. The twenty five tripeptide GSH-analogues were named after latin numbers and divided into four groups (A, B, C, D), incorporating alterations in every single amino acid position (A-C), plus in more than one positions (D). The results of the experimental procedures indicated only partial specificity for peptide analogue ΙΧ (γ-Glu-Thi-Gly) for inhibiting allozymes hGSTP1*A & hGSTP1*C, and analogue ΧΙ (γ-Glu-Cys(Acm)-Gly) for inhibiting allozymes hGSTP1*B & hGSTP1*C, without observing significant enzyme inhibition with the rest of the analogues. Furthermore, substrate activity was recorded with peptide analogues from groups A and C. The best results were obtained using peptides ΙΙ (Tic-Cys-Gly) and IV (Hyp-Cys-Gly) of group Α for allozyme hGSTP1*A (41,3% and 39,3% relative activity to GSH; FA, respectively) and peptide XV (γ-Glu-Cys-Sar) of group C, which showed significant activity for all three allozymes (17%, 60,8% and 67,7% FA for hGSTP1*A, hGSTP1*B and hGSTP1*C respectively).