Προσδιορισμός συστατικών και βιολογικής δράσης εκχυλισμάτων αρωματικών φυτών

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη οργανικού εκχυλίσματος από αρωματικά φυτά και συγκεκριμένα, ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των κυριότερων συστατικών τους και η εκτίμηση της βιολογική τους δράσης έναντι μικροοργανισμών του στόματος. Μελετήθηκαν τα φυτά: κρόκος (Crocus sativus L.), μελισσόχορτο (Melissa officinalis L.) και χαμομήλι (Matricaria recutita L.).

Για την παραλαβή του μεθανολικού εκχυλίσματος ακολουθήθηκαν τα παρακάτω βήματα: πραγματοποιήθηκε διαδοχική εκχύλιση υποβοηθούμενη από υπερήχους (35 KHz), με διαλύτες διαφορετικής πολικότητας κατά σειρά: πετρελαϊκός αιθέρας, εξάνιο, διαιθυλαιθέρας. Ακολούθως το φυτικό υλικό εκχυλίστηκε με μεθανόλη υπό μηχανική ανάδευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για δεκαέξι περίπου ώρες και η μεθανόλη εξατμίστηκε σε περιστροφικό συμπυκνωτή κενού. Στα εκχυλίσματα της μεθανόλης προσδιορίστηκε το ολικό φαινολικό περιεχόμενο (εκφρασμένο σε καφεϊκό οξύ) με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu και η αντιοξειδωτική δράση με τις μεθόδους ABTS•+ και DPPH•. Στη συνέχεια έγινε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των κύριων συστατικών των εκχυλισμάτων με υγρή χρωματογραφία συνδυασμένη με ανιχνευτή φωτοδιόδων (LC/DAD).

Το εκχύλισμα του κρόκου ήταν πλούσιο σε κροκίνες και συγκεκριμένα κυριάρχησαν οι trans-4-GG και η trans-3-Gg, στο εκχύλισμα του μελισσόχορτου επιράτησε το ροσμαρινικό οξύ και στο χαμομήλι ο γλυκοζίτης του φερουλικού οξέος και ο 7-Ο-γλυκοζίτης της απιγενίνης. Από άποψη φαινολικού περιεχομένου, μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά είχε το μελισσόχορτο με 59,00 mg καφεϊκού οξέος/g φυτικού υλικού, ακολούθησε το χαμομήλι με 37,74 mg καφεϊκού οξέος/g φυτικού υλικού και τέλος ο κρόκος με 23,66 καφεϊκού οξέος/g φυτικού υλικού. Όσον αφορά την αντιοξειδωτική δράση, με τη μέθοδο DPPH•, τα εκχυλίσματα έλαβαν την εξής κατάταξη αυξανόμενης αντιοξειδωτικής δράσης: κρόκος με τιμή IC50 859,1 μg/mL, χαμομήλι με τιμή IC50 52,7 μg/mL, μελισσόχορτο με τιμή IC50 9,6 μg/mL. Με τη μέθοδο ABTS•+ ισχύει η ακόλουθη κατάταξη αυξανόμενης αντιοξειδωτικής δράσης: κρόκος με τιμή TEAC 0,069 mmol Trolox/g εκχυλίσματος, χαμομήλι με τιμή TEAC 0,544 mmol Trolox/g εκχυλίσματος και μελισσόχορτο με τιμή TEAC 2,407 mmol Trolox/g εκχυλίσματος. Μετά τη σύγκριση των αποτελεσμάτων των παραπάνω μεθόδων διαπιστώθηκε συσχέτιση της αντιοξειδωτικής δράσης με το ολικό φαινολικό περιεχόμενο των εκχυλισμάτων.

Για την εκτίμηση in vitro της αντιμικροβιακής ικανότητας των εκχυλισμάτων έναντι των Streptococcus mutans LMG 14558T και Streptococcus sobrinus LMG14641T χρησιμοποιήθηκαν δύο διαλύτες, μεθανόλη-H2O και αιθανόλη-H2O σε αναλογία 70:30. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος διάχυσης υπερκειμένου σε άγαρ (Well diffusion assay-WDA) με διάφορες συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων για μια πρώτη εκτίμηση της αντιμικροβιακής δράσης τους. Επίσης, επειδή οι Streptococcus mutans και Streptococcus sobrinus εμπλέκονται σε παθογένειες της στοματικής κοιλότητας σχηματίζοντας βιοϋμένιο, προσδιορίστηκε η ικανότητα των εκχυλισμάτων να παρεμποδίζουν τον σχηματισμό του βιοϋμενίου και να αποικοδομούν το ήδη σχηματισμένο βιοϋμένιο.

Σχετικά με την αντιμικροβιακή ικανότητα των εκχυλισμάτων με τη μέθοδο WDA διαπιστώθηκε ικανοποιητική δράση των υδρομεθανολικών και υδροαιθανολικών εκχυλισμάτων έναντι των Streptococcus mutans και Streptococcus sobrinus. Αναφορικά με τη μελέτη παρεμπόδισης σχηματισμού του βιοϋμενίου, στην περίπτωση του Streptococcus mutans, και τα τρία υδρομεθανολικά εκχυλίσματα επέδειξαν ισχυρή δράση με αυτό του κρόκου να υπερισχύει ελάχιστα έναντι των εκχυλισμάτων των άλλων φυτών (90,69% παρεμπόδιση). Αντίστοιχα, και τα υδροαιθανολικά εκχυλίσματα επέδειξαν αξιοσημείωτη δράση με το υδροαιθανολικό εκχύλισμα του μελισσόχορτου να κυριαρχεί ελαφρώς έναντι των εκχυλισμάτων των άλλων φυτών (89,29% παρεμπόδιση). Έναντι του Streptococcus sobrinus ισχυρή δράση παρουσίασαν τα υδρομεθανολικά και υδροαιθανολικά εκχυλίσματα του μελισσόχορτου, με μικρή διαφορά μεταξύ τους (82,11% και 82,14% παρεμπόδιση αντίστοιχα). Όσον αφορά τη μελέτη αποικοδόμησης του ήδη σχηματισμένου βιοϋμενίου στις δύο ώρες όλα τα εκχυλίσματα εμφάνισαν μικρότερη δράση από ότι στη μελέτη παρεμπόδισης του σχηματισμένου βιοϋμενίου. Ακόμη, τα εκχυλίσματα παρουσίασαν οριακή δράση με αυτό του κρόκου να εμφανίζει ελαφρώς καλύτερα αποτελέσματα (27,76% αποικοδόμηση για τον Streptococcus mutans και 26,18% αποικοδόμηση για τον Streptococcus sobrinus). Στη μελέτη παρεμπόδισης σχηματισμού του βιοϋμενίου και αποικοδόμησής του, πιο ανθεκτικός εμφανίστηκε ο Streptococcus sobrinus. Γενικά, ισχυρότερη δράση εμφάνισαν τα εκχυλίσματα του κρόκου, κάτι που δεν συνδέεται με την αντιοξειδωτική τους δράση.

Επιστημονικό πεδίο: Χημεία, Γεωπονικές επιστήμες Λέξεις -Κλειδιά: Αντιοξειδωτική δράση; Αντιμικροβιακή δράση; Folin; DPPH; ABTS; Crocus sativus L., Melissa officinalis L., Matricaria recutita L., Streptococcus mutans; Streptococcus sobrinus

The aim of this thesis was to study organic extracts from aromatic plants, particularly the quantitative and qualitative determination of the major components and evaluation of their potential antioxidant and biological activity against microorganisms found in the oral cavity. The selected plants were saffron (Crocus sativus L.), lemon balm (Melissa officianalis L.), and chamomile (Matricaria recutita L.).

The procedure in order to obtain the methanolic extract is based on the following steps: the plants were subjected to sequential ultrasound assisted extraction (35 KHz) with solvents of different polarity in the following order: petroleum ether, hexane and diethyl ether. Afterwards, the samples were subjected to extraction by using magnetic stirring and methanol as a solvent, at room temperature, for about 16 hours. Once extraction was finished, the solvent was removed using a rotary vacuum evaporator until dryness. The content of total phenolic compounds in methanolic extracts was determined by Folin–Ciocalteu method (in terms of caffeic acid), while the antioxidant activity was estimated with ABTS•+ and DPPH• assay. LC-DAD (Liquid chromatograph equipped with a diode array detector) analysis was carried out in order to determine the quality and quantity of the major components.

The results indicate that the Crocus sativus L. methanolic extract was rich in crocins, especially trans-4-GG and cis-4-GG, in Melissa officinalis L. methanolic extract rosmarinic acid was prevalent, and in Matricaria recutita L. methanolic extract the major constituents were ferulic acid glucoside and apigenin 7-O-glucoside. Concerning the total phenolic content, the Melissa officinalis L. methanolic extract was the richest extract in phenolic components (59,00 mg caffeic acid/g dry plant), second in phenolic content was the Matricaria recutita L. methanolic extract (37,74 mg caffeic acid/g dry plant) and last the Crocus sativus L. methanolic extract (23,66 mg caffeic acid/g dry plant). With respect to the total antioxidant capacity, (DPPH• assay) the ranking in increasing order was: saffron methanolic extract (IC50=859,1 μg/mL), chamomile methanolic extract (IC50=52,7 μg/mL) and lemon balm methanolic extract (IC50=9,6 μg/mL). For the ABTS•+ assay the ranking in increasing order was as follows: saffron extract (TEAC=0,069 mmol Trolox/g extract), chamomile extract (TEAC=0,544 mmol Trolox/g extract) and lemon balm (TEAC= 2,407 mmol Trolox/g extract). The comparison between the results proved that there is a positive correlation between total phenolic content and antioxidant capacity of the extracts.

In order to determine the in vitro antimicrobial activity of the extracts against Streptococcus mutans LMG 14558T and Streptococcus sobrinus LMG14641T , two solvents were used, water- methanol and water- ethanol in 70:30 proportion. Well diffusion assay (WDA) was used as a first antimicrobial screening and extracts in various concentrations were tested against the bacterial strains. Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus attach to the pellicle on the tooth surface forming a dental biofilm and thus they are connected with the etiology and pathogenesis of human dental caries. The aqueous methanol and aqueous ethanol extracts have been investigated for their potential to inhibit the formation of the biofilm and destruct the biofilm that has been already formed by the bacteria.

Regarding the well diffusion assay, all the aqueous methanol and aqueous ethanol extracts showed activity against Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus. All three aqueous methanolic extracts showed great inhibitory activity against Streptococcus mutans (saffron methanolic extract was able to inhibit 90.69% the formation of biofilm). The aqueous ethanol extracts were active too and lemon balm aqueous ethanol extract was slightly more active than the rest of the extracts, showing a biofilm inhibition of 89.29%. Aqueous methanol and aqueous ethanol extracts from Melissa officinalis L. were effective against Streptococcus sobrinus (82.11% and 82.14% inhibition respectively). Concerning the determination of the destruction that extracts caused to the developed biofilm in two hours, all the extracts showed low activity (saffron extracts yielded the best results for both bacteria, 27.76% destruction for Streptococcus mutans and 26.18% destruction for Streptococcus sobrinus). Generally, the percentage of inhibition surpassed the percentage of destruction and saffron extract showed the greatest activity, even thought this fact is not in a positive correlation with its antioxidant activity. In both assays, Streptococcus sobrinus was more resistant than Streptococcus mutans.

Discipline: Chemistry, Agricultural Sciences Keywords: Antioxidant activity; Antimicrobial activity; Folin; DPPH; ABTS; Crocus sativus L., Melissa officinalis L., Matricaria recutita L., Streptococcus mutans; Streptococcus sobrinus