Κυτταρική έκφραση, απομόνωση, καθαρισμός και κρυστάλλωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη βλεφαριδογένεση (Nbp35 και Cfd1)

Abstract

Τα σύμπλοκα σιδήρου – θείου (Fe/S) αποτελούν τους πιο γνωστούς συμπαράγοντες πρωτεϊνών κι εμπλέκονται σε πολλές λειτουργίες του κυττάρου. Οι σημαντικότερες από αυτές, είναι η μεταφορά ηλεκτρονίων, η καταλυτική καθώς και η ρυθμιστική λειτουργία τους. Η απλούστερες μορφές συμπλόκων είναι είτε του τύπου [2Fe-2S] είτε του [4Fe-4S] και σχηματίζονται από ιόντα σιδήρου (Fe2+) ή (Fe3+) και ιόντα θείου (S2- ). Αν και η χημική τους δομή είναι αρκετά απλή, η βιοσύνθεσή τους απαιτεί τη λειτουργία αρκετών παραγόντων οι οποίοι στα ευκαρυωτικά κύτταρα οργανώνονται σε δύο βασικούς μηχανισμούς. Τα συστήματα ISC του μιτοχονδρίου και CIA του κυτταροπλάσματος, αποτελούν τους μηχανισμούς αυτούς και λειτουργούν στη σειρά για το σχηματισμό και τη μεταφορά των συμπλόκων στο κύτταρο. Οι πρωτεΐνες Nbp35 και Cfd1 αποτελούν παράγοντες του συστήματος CIA και λειτουργούν ως μήτρες για ο σχηματισμό των συμπλόκων Fe/S in vivo. Ανήκουν στην οικογένεια των P-loop NTPασών και συγκεκριμένα στην υποοικογένεια Mrp/Nbp35, όπως διευκρινίζεται από τη συντηρημένη αλληλουχία των τεσσάρων κυστεϊνών στο καρβοξυτελικό τους άκρο. Και οι δύο πρωτεΐνες περιέχουν μία αλληλουχία πρόσδεσης νουκλεοτιδίων, ενώ η Nbp35 περιέχει μία επιπλέον συντηρημένη αλληλουχία τεσσάρων κυστεϊνών στο άμινοτελικό της άκρο. Οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν ένα ετεροτετραμερές το οποίο προσδένει τέσσερα σύμπλοκα της μορφής [4Fe-4S] . Τα δύο κεντρικά αμινοξέα κυστεΐνης που βρίσκονται στο καρβόξυτελικό άκρο είναι απαραίτητα τόσο για το σχηματισμό του ετεροτετραμερούς συμπλόκου, όσο και για τη λειτουργία των πρωτεϊνών και την επιβίωση του κυττάρου. Επιπλέον, οι ομόλογες πρωτεΐνες NBP35 (Nubp1) και CFD1 (Nubp2) των ανώτερων ευκαρυωτών εμπλέκονται μαζί με τον παράγοντα KIFC5A στο σχηματισμό των βλεφαρίδων και λειτουργούν ως ρυθμιστές της βλεφαριδογένεσης, ενώ έχει μελετηθεί και η αλληλεπίδρασή τους με παράγοντες του συστήματος τσαπερονίων CCT/TRiC. Η κατανόηση της σχέσης δομής - λειτουργίας των NBP35 και CFD1, μπορεί να προσφέρει αρκετές πληροφορίες σχετικά με διάφορες ασθένειες που σχετίζονται με τη βλαφαριδογένεση . Στη παρούσα εργασία, μελετήσαμε μεθόδους υπερέκφρασης και καθαρισμού των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών Nbp35 και Cfd1 του οργανισμού Mus musculus σε κύτταρα E.coli. Οι 7 πρωτεΐνες που απομονώθηκαν, έπειτα από τον καθαρισμό χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή κρυστάλλων με στόχο τη μελέτη της τρισδιάστατης δομής με χρήση περίθλασης ακτίνων Χ. Η βελτιστοποίηση των τεχνικών καθαρισμού που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα σύμπλοκα Fe/S είναι απαραίτητα για τη σταθερότητα των πρωτεϊνών, ενώ η χρήση του συμπλόκου Nbp35 - Cfd1 μπορεί να χρησιμεύσει για τη δομική τους μελέτη.

Iron- sulfur (Fe/S) clusters belong to the most ancient co-factors of proteins and they are involved in many processes of the cell. The most important of them are electron transfer, catalysis and regulatory processes. The simplest Fe/S clusters are either of the [2Fe-2S] and [4Fe-4S] types and they contain either ferrous (Fe2+) or ferric (Fe3+) iron and sulfide (S2-). Despite their chemical simplicity Fe/S cluster biosynthesis requires numerous components which are organized in two basic mechanisms for the eukaryotic cells. The ISC mitochondrial and CIA cytosolic systems work in concert for the maturation and transfer of Fe/S clusters in the cell. The Nbp35 and Cfd1 proteins are components of the CIA system and they perform a scaffold function for Fe-S cluster synthesis in vivo. They belong to the P-loop NTPases family and especially in the Mrp/Nbp35 subclass, which is defined by their C-terminal motif, formed by four conserved cysteine residues. Both proteins contain a nucleotide binding motif, while Nbp35 contains also a conserved N-terminal motif of four cysteine residues. The two proteins form an hetero-tetramer complex which coordinates four [4Fe-4S] clusters. The two central cysteine residues of the C-terminal motif are essential for and Cfd1-Nbp35 hetero-tetramer formation, protein function and cell viability. On top of that, the homologous proteins of higher Eukaryotes NBP35 (Nubp1) and CFD1 (Nubp2), are involved together with protein KIFC5A on the formation of primary cilia, acting as regulators for ciliogenesis. NBP35 (Nubp1) and CFD1 (Nubp2) also are shown to interact with several members of the CCT/TRiC molecular chaperone system. Understanding the structure-function relationship of NBP35 and CFD1 and their interacting proteins could offer critical insights in the molecular pathology of ciliary disease. In the present study, we investigate the overexpression and purification methods of recombinant Nbp35 and Cfd1 proteins of the organism Mus musculus in E.coli cells. The purified proteins are used to generate crystals and solve their 3D structure by X-ray diffraction. The optimization methods of protein purification used in this study, show that Fe/S clusters are vital for their stability while the complex of Nbp35 - Cfd1 may be the key for structural identification using crystallography.