Μοριακές αλληλεπιδράσεις του Hsp90 συστήματος κατά την βλαστική και αναπαραγωγική φάση ανάπτυξης του φυτού Arabidopsis thaliana

Abstract

Οι πρωτεΐνες HSP90 αποτελούν ́ενα υψηλά συντηρημένο και άκρως εξειδικευμένο σύστημα μοριακού συνοδού το οποίο διευκολύνει την ωρίμανση ενός καθορισμένου συνόλου πρωτεϊνών κατέχοντας σημαντικούς βιολογικούς ρόλους. Τα υποστρώματα αυτά αποτελούνται κυρίως από πρωτεϊνικές κινάσες και υποδοχείς στεροειδών ορμονών που καταλαμβάνουν κεντρικές θέσεις ςε πολλά βιολογικά δίκτυα καθώς εμπλέκονται στον έλεγχο της κυτταρικής ομοιόστασης, τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση και την απόπτωση. Επιπλέον, το σύστημα HSP90 αποτελεί ένα κομβικό στοιχείο της πρωτεόστασης η οποία ελζγχει πολλά σημαντικά σηματοδοτικά μονοπάτια στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, οι HSP90 αποτελούν μόρια-κλειδιά για την ρύθμιση ποικίλων κυτταρικών λειτουργιών ουσιαστικών για την επιβίωση ενός οργανισμού και ασκούν ισχυρές επιδράσεις στην βιολογία των οργανισμών, τις ασθένειες και τις εξελικτικές διαδικασίες. Το σύστημα HSP90 ενέχεται επίσης στον φαινοτυπικό καθορισμό, ενώ παράλληλα ανοίγει νέους ορίζοντες για την θεραπεία του καρκίνου, αποτελόντας η ίδια η πρωτεΐνη φαρμακευτικό στόχο. Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας, με τη χρήση της τεχνολογικής προσέγγισης BiFC αποδείχθηκε ότι οι πρωτεΐνες HSP90.1 και HSP90.3 αλληλεπιδρούν με τον κομβικό ρυθμιστή της άνθησης TFL2 αλλά όχι με τον ρυθμιστή της ανάπτυξης των πετάλων RBE. Επιπρόσθετα, χρησιμοποιήθηκαν αποσιωπημένες σειρές Arabidopsis thaliana (RacRNAi και LFY/RNAi) που χαρακτηρίζονται από μειωμένα επίπεδα έκφρασης των Hsp90 σε ςυγκεκριμένους ιστούς και αναπτυξιακά στάδια, προκειμένου να μελετηθούν τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων WUS και CYCLINB1;1. Ιστοχημικές αναλύσεις GUS υπέδειξαν την απουσία έκφρασης του γονιδίου WUS σε φυτάρια τριών και πέντε ημερών RacRNAi (σειρά 10H) και την παρουσία έκφρασης του σε έμβρυα τησ ίδιασ σειράς, υποδεικνύοντας την πιθανή ύπαρξη ενός αναπτυξιακού παραθύρου κατά το οποίο το γονίδιο WUS παύει να εκφράζεται στα φυτά αυτά. Αντίστοιχη πειραματική προσέγγιση σε έμβρυα φυτών LFY/RNAi (σειρά 10.141) υπέδειξε την απουσία έκφρασης του γονιδίου WUS. Επιπλέον, ιστοχημικές GUS αναλύσεις έδειξαν πως στα φυτά RacRNAi 10H το πρότυπο της έκφρασης του γονιδίου CYCLINB1;1 παρουσιάζει διακυμάνσεις. Ανακεφαλαιώνοντασς, τα δεδομένα μας συνηγορούν υπέρ της εμπλοκής των HSP90 τόσο σε μονοπάτια που διέπουν τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του Arabidopsis (εμβρυογένεση) όσο και στη διαδικασία της άνθησης.

HSP90 proteins consist a highly conserved and extremely specialized molecular chaperone system, which facilitates the maturation of a defined group of proteins, playing crucial biological roles. These substrates are enriched in protein kinases and steroid hormone receptors occupying central positions in many biological networks as they are involved in the control of cellular homeostasis, proliferation, differentiation and apoptosis. Furthermore, the HSP90 chaperone system forms a proteostasis hub that controls numerous important signalling pathways in eukaryotic cells. As a consequence, HSP90 regulates a plethora of essential cellular functions for the survival of organisms and exerts marked effects on normal biology, disease and evolutionary processes. Moreover, HSP90 capacitates phenotypic variation while widens the horizons for the cure of cancer, being the molecule itself a pharmaceutical target. Objectives of the current master thesis were a) the analysis of the HSP90 protein interactions with two proteins involving in flowering, TFL2 and RBE and b) the study of WUS, a central player in shoot meristem regulation, and CYCLINB1;1 promoters transcriptional activity. We used the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay to demonstrate in planta interactions among TFL2, HSP90.1 and HSP90.3. However, no interactions were observed between RBE, HSP90.1 and HSP90.3. Transgenic Arabidopsis RNAi plants (lines 10H and 10.141) harbouring a transcriptional fusion between WUS and the reporter gene (b-glucuronidase) GUS, were analysed for GUS expression in 3, 5 day-old seedlings and in mature flowers. In 10H line, no GUS expression was detected in 3 and 5 day-old seedlings. However, the WUS promoter was able specifically to direct GUS expression in developing seeds of RNAi 10H plants but not in RNAi 10.141 plants. Furthermore, transgenic Arabidopsis RNAi plants (line 10H) expressing a transcriptional fusion between CYCLINB1;1 promoter and the reporter gene GUS, were analysed for GUS expression in 3, 5 day-old seedlings and in mature flowers. The CYCLINB1;1 promoter was active in all tissues tested.