Παρασκευή τυριού άλμης με την χρήση προπιονικών βακτηρίων και in vitro μελέτη των πιθανών αντικαρκινικών του ιδιοτήτων

Abstract

Η εργασία αυτή αποσκοπεί στην παρασκευή λευκού τυριού άλμης με την χρήση προπιονικών βακτηρίων και στην in vitro αξιολόγηση αυτού όσον αφορά πιθανές αντικαρκινικές ιδιότητες χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά ΗΤ-29. Αρχικά επιλέχθηκε το κατάλληλο στέλεχος προπιονικών βακτηρίων (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii LMG 16424Τ) για τις τυροκομήσεις αλλά και θρεπτικό υλικό για την επιλεκτική αρίθμηση των στελεχών καθώς και πραγματοποιήθηκε προσομοίωση της συμπεριφοράς των επιλεγμένων στελεχών (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 87, Streptococcus thermophilus ACA-DC 29 και P. shermanii LMG 16424Τ) στο γάλα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν 3 τυροκομήσεις όπου παρασκευάστηκαν 2 διαφορετικά τυριά, με (Β: L. bulgaricus ACA-DC 87, S. thermophilus ACA-DC 29 και P. shermanii LMG 16424Τ) και χωρίς προπιονικά βακτήρια (Α: L. bulgaricus ACA-DC 87, S. thermophilus ACA-DC 29), κατά τη διάρκεια των οποίων πραγματοποιήθηκαν μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις σε επιλεγμένες ημέρες (0, 1, 6, 15, 30 και 60 d). Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν καταμετρήθηκαν προπιονικά βακτήρια στο τυρί στο οποίο δεν είχαν προστεθεί ως συμπληρωματική εναρκτήρια καλλιέργεια. Όσον αφορά τις φυσικοχημικές αναλύσεις, μετρήθηκε το pH των τυριών, η υγρασία καθώς επίσης πραγματοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης προκειμένου να προσδιοριστούν τα σάκχαρα και τα οξέα στα 2 τυριά. Είναι ενδιαφέρον ότι δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα σημεία δειγματοληψίας προπιονικό οξύ στο τυρί που δεν περιέχει προπιονικά βακτήρια. Μετά το πέρας της ωρίμανσης των τυριών (60 d), πραγματοποιήθηκε οργανοληπτικός έλεγχος των τυριών από 14μελή ομάδα του εργαστηρίου Γαλακτοκομίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, όπου ξεχώρισε το τυρί Β1. Εν συνεχεία, βασιζόμενη στη βιβλιογραφία σύμφωνα με την οποία τα προπιονικά βακτήρια παράγουν προπιονικό οξύ το οποίο ανήκει στα λιπαρά οξέα βραχείας αλύσου και επάγει την απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του γαστρεντερικού, πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση των τυριών και προσδιορισμός της βιωσιμότητας των κυττάρων ΗΤ-29 κατόπιν επώασης με τα υδατικά εκχυλίσματα των τυριών των τριών τυροκομήσεων για 72 h. Τα αποτελέσματα ωστόσο έδειξαν ότι μόνο το τυρί Β της 1ης τυροκόμησης συνάδει με τα μέχρι τώρα δημοσιευμένα αποτελέσματα ενώ τα άλλα τυριά έδειξαν αντίστροφα αποτελέσματα, δηλαδή το τυρί Α εμφάνισε μικρότερη επιβίωση συγκριτικά με το Β. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί είτε στην εξάντληση των θρεπτικών συστατικών στις υψηλές συγκεντρώσεις (αραίωση ½ και ¼) είτε στην υψηλή ωσμωμοριακότητα των τυριών που οδηγεί στο θάνατο των κυττάρων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε χρώση DAPI στα κύτταρα ΗΤ-29 τα οποία προηγουμένως είχαν επωαστεί με τα υδατικά εκχυλίσματα των τυριών της 1ης τυροκόμησης και ανιχνεύθηκαν αποπτωτικοί πυρήνες μόνο στα κύτταρα που είχαν επωαστεί με το τυρί Β1.

This study aims at the production of white-brined cheese with the use of propionic acid bacteria and the in vitro evaluation of potential anticancer properties. Initially, we chose the suitable strain of PAB (P. shermanii LMG 16424Τ) and at the same time the growing media for selective enumeration of the chosen strains for the cheesemaking. We simulated the behavior of the selected strains in milk UHT full fat and then proceeded with the cheesemaking in which we produced 2 types of cheese, A (L. bulgaricus ACA-DC 87, S. thermophilus ACA-DC 29) and B (L. bulgaricus ACA-DC 87, S. thermophilus ACA-DC 29 και P. shermanii LMG 16424Τ). During the ripening of the cheese and in selected days (0, 1, 6, 15, 30, 60 d) were conducted microbiological and physicochemical analyses. It is notable that there was no detection of PAB in the cheese A. Moreover, physicochemical analyses such as pH, moisture and HPLC were performed. Interestingly, propionic acid was not detected in any of the sampling points of the cheese A. After the ripening of the cheese (60d), sensory evaluation took place in which participated 14 members of the laboratory of Dairy Science of Agricultural University of Athens. Subsequently, based on the literature according to which PAB produce propionic acid which belongs to the Short Chain Fatty Acids and induces apoptosis in colorectal cancer cells, we proceeded with the homogenization of the cheeses and the determination of the viability of HT-29 cells when they were incubated with the 2 cheeses for 72h. However the results showed that only the cheeses of the first cheesemaking were consistent with the published results whereas the other cheeses showed reversed results, i.e. cheese A displayed lower survival when compared to cheese B. This could be attributed to either the depletion of nutrients during the incubation of HT-29 cells at high concentrations (1/2 and 1/4) or to high osmolatiry values (>0,5 osm/kg) which leads to the death of the cells. Finally, DAPI staining was performed in ΗΤ-29 cells which were previously incubated with the cheese A1 and B1. We found that the nuclei of the cells which were incubated with the cheese B1, showed apoptosis features.