Κλωνοποίηση, έκφραση και χαρακτηρισμός των ισοενζύμων της μεταφοράσης του γλουταθείου από Erwinia carotovora

Abstract

Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GST) μπορούν να μεταβολίσουν πλήθος υποστρωμάτων κύρια σε διαδικασίες αποτοξίνωσης αλλά και σε πλήθος μεταβολικών διαδικασιών, κάτι που τους δίνει προοπτικές να αξιοποιηθούν σε πολλές βιοτεχνολογικές εφαρμογές που άλλωστε πληθαίνουν τα τελευταία χρόνια. Το βακτήριο Erwinia carotovora subsp. Atroseptica SCRI1043 είναι πανταχού παρών φυπαθογόνο. Η επιτυχία του ως τέτοιο πιθανότατα οφείλεται σε ένζυμα που διαθέτει και το κάνουν ανθεκτικό στους μηχανισμούς άμυνας των φυτών, ανάμεσα στα οποία είναι και οι GSTs. Το βακτήριο αυτό εκφράζει τουλάχιστον έξι ισοτύπους GSTs, παρουσιάζοντας ενδιαφέρον από την άποψη αυτή. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε κατορθωτό να απομονωθούν τα έξι γονίδια που κωδικοποιούν αυτές τις GSTs από το γονιδίωμα του βακτηριακού αυτού στελέχους μέσω PCR. Ακολούθησε κλωνοποίηση των γονιδίων σε φορείς έκφρασης pCR ® T7/CT-TOPO ® και ετερόλογη έκφρασή του σε κύτταρα E. coli BL21 (DE3). Μετά απ’ αυτήν προσδιορίστηκε φωτομετρικά η καταλυτική τους ικανότητα απέναντι στο υπόστρωμα CDNB. Έτσι πραγματοποιήθηκε το πρώτο βήμα για τη μελέτη των ενζύμων αυτών και την ενδεχόμενη βιοτεχνολογική τους αξιοποίηση