Το CSSL (Concentrated Spent Sulphite Liquor) είναι το υγρό απόβλητο της βιομηχανίας παραγωγής χαρτοπολτού και χάρτου, το οποίο προέρχεται από την όξινη θειώδη μέθοδο πολτοποίησης του ξύλου Eucalyptus globulus. Το απόβλητο αυτό περιέχει σημαντική ποσότητα φαινολικών ουσιών (12 g•L-1) και υψηλή συγκέντρωση σακχάρων (176,4 g•L-1), κυρίως ξυλόζης. Στην παρούσα μεταπτυχιακή μελέτη πραγματοποιήθηκαν πειράματα με το απόβλητο CSSL για τον διαχωρισμό, την ποσοτική και ποιοτική ανάλυση των περιεχόμενων φαινολικών συστατικών, καθώς και για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος μέσω μικροβιακών ζυμώσεων. Σκοπός αυτών των πειραμάτων ήταν να αξιοποιηθεί αυτή η ανανεώσιμη πρώτη ύλη ώστε να επιφέρει βιωσιμότητα και αειφορία στη βιομηχανία.
Για την ανάκτηση των φαινολικών ενώσεων αρχικά πραγματοποιήθηκε εκχύλιση με οργανικούς διαλύτες. Σε σύγκριση με το χλωροφόρμιο, το διαιθυλαιθέρα, το τριχλωροαιθυλένιο και το βενζόλιο, με τον οξικό αιθυλεστέρα ανακτήθηκε το μεγαλύτερο ποσοστό των φαινολικών ουσιών από το απόβλητο. Με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu η συγκέντρωση των ολικών φαινολικών συστατικών του αποβλήτου CSSL εκτιμήθηκε ίση με 9,08 g GAE•L-1, μετά από εκχύλιση ενός σταδίου με οξικό αιθυλεστέρα με αναλογία αποβλήτου προς διαλύτη 1:3 v/v. Επιπλέον, αυξάνοντας τα στάδια της εκχύλισης από ένα σε τρία ανακτήθηκε σχεδόν όλη η ποσότητα των φαινολικών συστατικών (94%) και η αναλογία αποβλήτου προς διαλύτη 1:3 v/v αποδείχτηκε αποτελεσματικότερη από την 1:2 v/v. Η αντιοξειδωτική ικανότητα εκτιμήθηκε με τη μέθοδο DPPH και βρέθηκε πως το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα είχε τον υψηλότερο δείκτη αντιοξειδωτικής δραστικότητας (ΑΑΙ = 6,88) σε σχέση με τις τιμές ΑΑΙ των υπόλοιπων διαλυτών που χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση των φαινολικών συστατικών. Στη συνέχεια, ταυτοποιήθηκαν με την μέθοδο HPLC-DAD τα εξής φαινολικά συστατικά: συριγγικό οξύ, λαρισιρεσινόλη, βανιλλικό οξύ, ισοραμνετίνη, συριγγαλδεΰδη, βανιλλίνη, ακετοσυριγγόνη και καφεϊκό οξύ, καθώς επίσης ελλαγικό και γαλλικό οξύ, τα οποία βρέθηκαν σε υψηλές συγκεντρώσεις στο απόβλητο CSSL (699,3 mg•L-1 και 622,8 mg•L-1, αντίστοιχα).
Κατά τη διεξαγωγή των ζυμώσεων, παρατηρήθηκε ότι το βακτήριο Basfia succiniciproducens ανταποκρίνεται καλύτερα στο υπόστρωμα αραιωμένου 1:10 CSSL, αλλά και στο υπόστρωμα εκχυλισμένου CSSL, παρουσιάζοντας μεγαλύτερη απόδοση παραγωγής ηλεκτρικού οξέος και μικρότερη απόδοση παραγωγής παραπροϊόντων σε σχέση με το βακτήριο Actinobacillus succinogenes. Στην περίπτωση όπου αφαιρέθηκε το 76% των φαινολικών συστατικών, χρησιμοποιώντας οξικό αιθυλεστέρα ως διαλύτη στην εκχύλιση, η τιμή της απόδοσης παραγωγής του ηλεκτρικού οξέος από το B. succiniciproducens αυξήθηκε κατά 16%, φτάνοντας την τιμή 0,58 g•g-1, και η τιμή της παραγωγικότητας κατά 25%, σε σχέση με το μη επεξεργασμένο απόβλητο. Ενώ, για το A. succinogenes η τιμή της απόδοσης παραγωγής του ηλεκτρικού οξέος αυξήθηκε κατά 25,6%, φτάνοντας την τιμή 0,49 g•g-1, και η τιμή της παραγωγικότητας κατά 30%, αντίστοιχα. Άρα το βακτήριο A. succinogenes παρεμποδίζεται περισσότερο από την παρουσία φαινολικών συστατικών στο μέσο της ζύμωσης από ότι το B. succiniciproducens. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκαν ζυμώσεις με το A. succinogenes σε θρεπτικό υπόστρωμα μίγματος καθαρών σακχάρων, με συγκέντρωση του κάθε σακχάρου όμοια με αυτή του αραιωμένου 1:10 CSSL, και προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων γαλλικού οξέος (0,1 g•L-1, 0,5 g•L-1, 1 g•L-1 και 2 g•L-1). Στη συγκέντρωση 2 g•L-1, παρατηρήθηκε η μεγαλύτερη μείωση της απόδοσης (18,5%) και της παραγωγικότητας (26,7%) του ηλεκτρικού οξέος, καθώς και αύξηση της απόδοσης των παραπροϊόντων (33,3%) σε σχέση με το θρεπτικό υπόστρωμα όπου δεν είχε πραγματοποιηθεί προσθήκη της παρεμποδιστικής ουσίας.
A major industrial sector, that generates vast amounts of lignocellulosic wastes with environmental negative impact, is the pulp and paper industry. The thick liquid waste stream from the sulphite pulping process of hardwood Eucalyptus globulus is called Concentrated Spent Sulphite Liquor (CSSL) and it contains high quantities of various C5 and C6 monosaccharides (176.4 g•L-1), mainly xylose, and significant amount of phenolic compounds (12 g•L-1). In the present study, several experiments were performed with the CSSL for the separation and the quantitative and qualitative analysis of the content of phenolic compounds, as well as for the evaluation of succinic acid production via fermentation by two selected bacteria. The aim of these experiments was the valorization of this renewable raw material of the pulp and paper industry in order to bring viability and sustainability to the industry.
Initially, liquid-liquid extraction with organic solvents took place for the recovery of phenolic compounds. In comparison with chloroform, diethyl ether, trichloroethylene and benzene, with the ethyl acetate solvent was extracted the highest percentage of phenolic compounds contained in the CSSL. The ethyl acetate extract (one step extraction, hydrolysate to solvent volume ratio was 1:3 v/v) was analyzed in terms of gallic acid equivalents by the Folin-Ciocalteu colorimetric method and the concentration of total phenolic compounds was estimated equal to 9.08 g GAE•L-1. Moreover, increasing the steps of extraction from one to three almost the whole amount of phenolic compounds (94%) was separated and the volume ratio of hydrolysate to solvent 1:3 v/v was more efficient than the ratio 1:2 v/v. The antioxidant activity was determined by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) method and the ethyl acetate extract had the highest antioxidant activity index (AAI = 6.88) compared with the values of AAI of the other solvents used for the extraction of phenolic components. Then, the phenolic compounds were identified by HPLC-DAD method: syringic acid, lariciresinol, vanillic acid, isorhamnetin, syringaldehyde, vanillin, acetosyringone and caffeic acid, as well as ellagic and gallic acid, which had the highest concentrations in comparison to the other phenolics found in CSSL extract (699.3 mg•L-1 and 622.8 mg•L-1, respectively).
During fermentations with industrially derived CSSL, it was observed that Basfia succiniciproducens achieved higher succinic acid production yield and less by-products formation when the substrate was the diluted 1:10 CSSL or the extracted CSSL, than Actinobacillus succinogenes. In case of removing 76% of the total phenolic compounds, using ethyl acetate as extraction solvent, the rate of yield of succinic acid production by B. succiniciproducens was increased by 16%, reaching the value 0.58 g•g-1, and productivity was increased by 25%, in comparison to untreated CSSL. Whereas for the bacterium A. succinogenes, the yield of succinic acid was increased by 25.6%, reaching the value 0.49 g•g-1, and productivity was increased by 30%, respectively. Therefore, A. succinogenes was more inhibited than B. succiniciproducens from the phenolic compounds present in the fermentation medium. For this reason, a set of fermentations with A. succinogenes was also carried out using mixed sugars with a sugar proportion similar to the one contained in diluted 1:10 CSSL. Different concentrations of gallic acid (0.1 g•L-1, 0.5 g•L-1, 1 g•L-1 and 2 g•L-1) were added to assess the ability of A. succinogenes to consume the sugars and to produce succinic acid when the fermentation broth contained an inhibitory compound. At the concentration of 2 g•L-1, it was observed the greatest decrease of the yield (18.5%) and the productivity (26.7%) of succinic acid and the greatest increase of the yield of by-products (33.3%) in comparison with the substrate where there had been no addition of gallic acid.
