Γενετικός χαρακτηρισμός μεταλλαγμένων στελεχών του βακτηρίου Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 ανθεκτικών στο ωσμωτικό στρες

Abstract

Ο Lactococcus lactis ssp. cremoris είναι ένα οξυγαλακτικό βακτήριο με μεγάλη τεχνολογική και οικονομική σημασία. Κατά την παραγωγή τροφίμων εκτίθεται σε στρεσογόνες συνθήκες, και η απόκρισή του σε αυτές αποτελούσε και αποτελεί αντικείμενο μελέτης εδώ και πολλά χρόνια. Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε η δημιουργία και ο χαρακτηρισμός γενετικά τροποποιημένων στελεχών του L. lactis ssp. cremoris MG1363 ώστε αυτά να καταστούν ανθεκτικά σε υπερωσμωτικές συνθήκες, με την εισαγωγή και ενσωμάτωση του θερμοευαίσθητου πλασμιδιακού φορέα pGh9:ISS1 στο χρωμόσωμά του. Στόχος ήταν επίσης η μελέτη και ο χαρακτηρισμός πέντε μεταλλαγμένων στελεχών που είχαν προκύψει από προηγούμενες μελέτες. Η απομόνωση νέων μεταλλαγμένων στελεχών δεν κατέστη εφικτή. Η ανάλυση που έγινε στα παλαιότερα μεταλλαγμένα στελέχη έδειξε πως το πλασμίδιο ενσωματώθηκε στο χρωμόσωμα του MG1363. Η κλωνοποίηση των σημείων ένωσης του πλασμιδίου με το χρωμόσωμα του MG1363 ήταν επιτυχής στα τέσσερα από τα πέντε μεταλλαγμένα στελέχη. Μετά την αλληλούχηση των πλευρικών αλληλουχιών του γονιδιώματος των μεταλλαγμένων στελεχών, με εργαλεία βιοπληροφορικής έγινε σύγκριση των αλληλουχιών αυτών με γονίδια του MG1363 και εκτιμήθηκε η ακριβής θέση στην οποία ενσωματώθηκε το πλασμίδιο pGh9:ISS1 στο χρωμόσωμα του MG1363. Η ενσωμάτωση του πλασμιδίου διέκοψε το ίδιο γονίδιο και στα τέσσερα μεταλλαγμένα στελέχη. Η πρωτεΐνη που κωδικοποιεί το γονίδιο αυτό είναι μία συντηρημένη υποθετική πρωτεΐνη και ένα από τα τμήματα της με γνωστό ρόλο είναι η αντλία μεταφοράς ιόντων. Φαίνεται πως η συγκεκριμένη πρωτεΐνη συμμετέχει στο ωσμωτικό στρες, προσδίδοντας ευαισθησία στο βακτήριο, αφού με την απενεργοποίηση του γονιδίου υπάρχει μια ενδεχόμενη συσχέτιση με την επίδειξη ανθεκτικότητας του οργανισμού στο συγκεκριμένο στρες. Οι πληροφορίες που προκύπτουν από την εργασία αυτή είναι ένα βήμα προς την κατανόηση της συμπεριφοράς τόσο του L. lactis ssp. cremoris όσο και των οξυγαλακτικών βακτηριών γενικότερα σε συνθήκες ωσμωτικού στρες.

Lactococcus lactis ssp. cremoris is a lactic acid bacterium of great technological and economical importance. During food production procedure it is exposed to stressful conditions, and its response to them has been the subject of studies for many years. The purpose of this study was to generate and characterize genetically modified mutants of L. lactis ssp. cremoris MG1363 resistant to hyperosmotic stress, by inserting the thermosensitive plasmid vector pGh9:ISS1 in its genome. Another aim of this study was to characterize five osmotic mutants that had been isolated in previous studies. The isolation of new mutants was not possible. The analysis performed in the other five mutants showed that the plasmid was inserted into the genome of MG1363. The cloning of the junctions of the plasmid with the genome of MG1363 was successful in four out of the five mutants. After the flanking sequences of the mutants’ genome were sequenced, they were compared to MG1363 genes and the exact position where the plasmid vector pGh9:ISS1 was inserted into the MG1363 genome was found using bioinformatic tools. The insertion of the plasmid vector interrupted the same gene in all four mutants. The protein encoded by this gene is a conserved hypothetical protein and one of its domains is transporter-associated. It seems that this protein is osmotic-stress-involved, conferring sensitivity to the bacterium. Resistance to this stress is possibly related to the inactivation of the encoder gene. The information derived from this work will help understanding the response of L. lactis ssp. cremoris and lactic acid bacteria in general to osmotic stress.