Παραγωγή κυτταρικής μάζας και μικροβιακών λιπιδίων κατά την αύξηση του μικροοργανισμού Cryptococcus curvatus σε υποστρώματα με βάση την ξυλόζη

Abstract

Συγκεκριμένα σκοπός είναι η αύξηση του μικροοργανισμού σε ανακινούμενες φιάλες (υπό ασηπτικές συνθήκες) με συνθετικά υποστρώματα αυξανόμενης συγκέντρωσης ξυλόζης (εύρεση ορίων αντοχής του στελέχους/πιθανή καταστολή του μεταβολισμού από υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος) και η αριστοποίηση των συνθηκών ζύμωσης. Τέλος, θα πραγματοποιηθεί κλιμάκωση μεγέθους της επιλεγμένης ζύμωσης με τα επιθυμητά αποτελέσματα σε καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρες. Το στέλεχος του ζυμομύκητα που θα χρησιμοποιηθεί είναι το Cryptococcus curvatus NRRL Y 1511. Αρχικά θα αυξηθεί σε καλλιέργειες σε ανακινούμενες φιάλες υπό ασηπτικές συνθήκες (σε συγκεκριμένο pH και θερμοκρασία), πεπληρωμένες με συνθετικά υποστρώματα με βάση την ξυλόζη. Οι αρχικές συγκεντρώσεις της ξυλόζης θα είναι αυξανόμενες με το σκεπτικό αφενός της παραγωγής μεγαλύτερης ποσότητας μονοκυτταρικού λίπους και αφετέρου της εύρεσης του ορίου τυχούσας καταστολής του μεταβολισμού λόγω συγκέντρωσης υποστρώματος. Μετά την αριστοποίηση των συνθηκών ζύμωσης, θα επιλεχθεί η καλλιέργεια εκείνη με τα επιθυμητά αποτελέσματα προς κλιμάκωση μεγέθους και ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα. Κατά τη δειγματοληψία (μετά τη μέτρηση του pH και της ποσότητας του διαλελυμένου οξυγόνου), θα πραγματοποιηθεί στο μέσο της ζύμωσης διαχωρισμός της παραγόμενης βιομάζας από το υπερκείμενο υγρό με φυγοκέντριση. Θα υπολογιστεί η ποσότητα της βιομάζας με μέθοδο ξηρού βάρους. Από την ξηρή βιομάζα θα πραγματοποιηθεί εκχύλιση, με χρήση διαλύτη, του παραγόμενου ενδοκυτταρικού λίπους και έπειτα θα υπολογισθεί η ποσότητά του μετά την εξάτμιση του διαλύτη. Επίσης, θα μελετηθεί η σύσταση του παραγόμενου λίπους, μέσω της ανάλυσης του προφίλ των λιπαρών οξέων που εμπεριέχονται σε αυτό. Αυτό θα πραγματοποιηθεί μέσω της μεθυλεστεροποίησης των λιπαρών οξέων και της ανάλυσής τους με αέρια χρωματογραφία. Τέλος θα πραγματοποιηθούν και αναλύσεις στο υπερκείμενο υγρό της ζύμωσης με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης για την εύρεση της κατανάλωσης του υποστρώματος και την παραγωγή τυχόν μεταβολιτών. Τα σημαντικότερα αποτελέσματα που καταγράφηκαν ήταν η αυξανόμενη συγκέντρωση της βιομάζας συναρτήσει της συγκεντρώσεως του υποστρώματος με την μέγιστη τιμή της να σημειώνεται στην ζύμωση των 110 g/L και ήταν 26,44 g/L. Στον βιοαντιδραστήρα η τιμή της βιομάζας ανήλθε σε 21,64 g/L. Επίσης, η μέγιστη τιμή του λίπους καταγράφηκε στην ζύμωση των 75 g/L και ήταν 3,78 g/L και για τον βιοαντιδραστήρα η συγκέντρωση του λίπους ανερχόταν σε 3,12 g/L. Τέλος, ο ρυθμός παραγωγής βιομάζας ήταν μέγιστος στην ζύμωση των 25 g/L και η τιμή του ήταν YX/S= 0,522 g/L , ενώ ο ρυθμός παραγωγής λίπους γίνεται μέγιστος στη ζύμωση των 75 g/L και η τιμή του είναι YL/X =0,204 g/L. Για την ζύμωση των 80 g/L στον βιοαντιδραστήρα, οι τιμές του ρυθμού παραγωγής βιομάζας και του ρυθμού παραγωγής λίπους ήταν 0,34 και 0,144, αντίστοιχα.

Specifically the purpose is to increase the micro-organism in shake flasks (under aseptic conditions) with synthetic substrates increasing concentration xylose (Finding strength limits of the strain / possible suppressing the metabolism of high substrate concentration) and optimization of fermentation conditions. Finally, we performed scaling size of the selected fermentation with the desired results in cultures in bioreactors. The yeast strain used is Cryptococcus curvatus NRRL Y 1511. Initially will grow in cultures in shake flasks under aseptic conditions (in particular pH and temperature), filled with synthetic substrates based on xylose. The initial concentrations of xylose is growing on the grounds both production greater amount unicellular fat and secondly of finding the limit arbitrary suppression of metabolism due to substrate concentration. After the optimization of fermentation conditions, will be selected by culturing the one with the desired effects for scaling size and bioreactor fermentations. When sampling (after measuring the pH and the amount of dissolved oxygen), will be held in the fermentation medium separation of biomass produced from the supernatant by centrifugation. We will calculate the amount of biomass dry weight method. From the dry biomass extraction performed using solvent, the produced intracellular fat and will then calculate the quantity after evaporation of the solvent. Also, we will study the composition of fat produced by the analysis of fatty acid profiles contained therein. This will be done through the methyl-esterification of fatty acids and their analysis by gas chromatography. Finally we realized and analysis in the supernatant of fermentation by high pressure liquid chromatography to find the consumption of substrate and produce any metabolites. The most significant results were recorded the increasing concentration of the biomass as a function of substrate concentration with a maximum value can be noted in the fermentation of 110 g / L and was 26,44 g / L. In the bioreactor the value of the biomass was 21,64 g / L. Also, the maximum value of the fat was recorded to the fermentation 75 g / L and it was 3,78 g / L and the concentration of the bioreactor fat amounted to 3,12 g / L. Finally, the biomass production rate was highest in the fermentation of 25 g / L and the price was YX / S = 0,522 g / L, while the fat production rate becomes maximum in the fermentation of 75 g / L and the price is YL / X = 0,204 g / L. For the fermentation of 80 g / L in the bioreactor, the values of the rate of biomass production and fat production rate was 0.34 and 0.144, respectively.