Δομική ανάλυση κυκλοφιλινών

Abstract

Οι κυκλοφιλίνες, ένζυμα με μεγάλο ποσοστό συντήρησης σε όλους τους οργανισμούς, έχουν τη χαρακτηριστική ιδιότητα να καταλύουν την ισομερίωση της προλίνης μεταξύ της cis και της trans διαμόρφωσης. Οι αλληλομετατροπές των διαμορφώσεων της προλίνης είναι κρίσιμες για την επίτευξη της τριτοταγούς δομής των πρωτεΐνών-στόχων των κυκλοφιλινών. Οι κυκλοφιλίνες επίσης παρουσιάζουν δράση σαπερόνης και ενέχονται σε πολλές βιολογικές διαδικασίες με ενδιαφέρον και στην ιατρική, όπως η αναγνώριση της κυκλοσπορίνης Α και της πρωτεΐνης του καψιδίου του ΗΙV. Στο πλαίσιο της εργασίας αυτής πραγματοποιήθηκε δομική ανάλυση μεταλλαγμάτων της κυκλοφιλίνης Α (CypA) της προερχόμενης από το κυτόπλασμα του E.coli χρησιμοποιώντας μοριακά μοντέλα που δημιουργήθηκαν στον ιστότοπο SWISS MODEL. Σκοπός ήταν η ερμηνεία αποτελεσμάτων βιοδοκιμών όπου αξιολογήθηκε η ενζυμική δράση και η δράση σαπερόνης των μεταλλαγμάτων, καθώς και οι φαινοτυπικες αλλαγές των βακτηριακών καλλιεργειών σε σύγκριση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου. Επίσης σχεδιάστηκαν πειράματα κρυστάλλωσης για την αποσαφήνιση της κρυσταλλικής δομής, τα οποία βρίσκονται ακόμα σε εξέλιξη, και πραγματοποιήθηκε σειρά πειραμάτων ελέγχου θερμικής αποδιάταξης (Thermofluor) των μεταλλαγμένων πρωτεΐνών. Οι βιοδοκιμές σε συνδυασμό με τη δομική ανάλυση κατέδειξαν τη σημασία των αμινοξέων R43, F99, M49 που ανήκουν στο ενεργό κέντρο της CypA. Εκτός ενεργού κέντρου οι μεταλλάξεις G53V και Q61R επηρέασαν σημαντικά την ενζυμική δράση. Η δομική μελέτη κατέδειξε τα δομικά προβλήματα που η πρώτη μετάλλαξη δημιούργησε και διερεύνησε τις αιτίες για τη δεύτερη μετάλλαξη. Η θερμική αποδιάταξη φαίνεται να σχετίζεται με μεταλλάξεις που διαταράσσουν δομικά την πρωτεΐνη δημιουργώντας κενούς χώρους, όπως οι W118R και M85I. Σε αυτές τις περιπτώσεις η θερμική αποδιάταξη της πρωτεΐνης ήταν αισθητή και, ενώ δε φαίνεται να επηρεάζεται η ενζυμική δράση, επηρεάζεται ο φαινότυπος. Η δράση σαπερόνης διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα με μικρές διακυμάνσεις σε όλα τα μεταλλάγματα που εξετάστηκαν.

Cyclophilins are highly conserved enzymes which catalyze the interconversion between cis- and trans- proline residues. This function is critical for assisting the folding process of protein substrates. Cyclophilins also act as chaperones and are involved in numerous biological processes of medical interest, like cyclosporin A and HIV capsid protein recognition. In this work, structural analysis of cytopasmic E.coli cyclophilin A (CypA) was performed, utilizing molecular models created by SWISS MODEL, aiming to explain experimental results on mutant enzyme activity, chaperone activity and phenotype alterations in relation to wild type proteins. In order to determine crystal structures, crystallization experiments have also been designed and performed and are in progress. A series of Thermofluor experiments were performed to assess thermal stability of the mutants. Enzyme activity results combined with structural study confirmed the functional key role of R43, F99, M49 residues, which are part of the CypA active site. Besides, G53V and Q61R mutations severely affected enzyme activity. Structural studies provided explanations for these findings in the case of G53V and investigated possible causes for the Q61R loss in activity. There seems to be a clear pattern of thermal destabilization in mutants like W118R and M85I, which disturb protein hydrophobic packing. In these cases, not only mutations created empty spaces in protein structure but the phenotype is also altered. Chaperone activity was not severely affected in any of mutants studied.