Αξιολόγηση και βελτιστοποίηση της παραγωγής μεταβολικών προϊόντων με χρήση ελαιογόνων ζυμών

Abstract

Σκοπός της παρούσας πτυχιακής μελέτης ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας παραγωγής μικροβιακού λίπους τριών πρόσφατα απομονωμένων στελεχών ζυμών, PC_A2, PP_D3, MD_F1, τα οποία σε προηγούμενες μελέτες έδειξαν δείγματα λιποσυσσώρευσης, και η επιλογή του καταλληλότερου στελέχους για περαιτέρω μελέτη αξιολόγησης των βέλτιστων παραμέτρων που επηρεάζουν τη διαδικασία της ζύμωσης. Παράλληλα διερευνήθηκε και η παραγωγή άλλων μεταβολικών προϊόντων που δύνανται να προκύψουν από τις ζυμώσεις αυτές. Για το σκοπό αυτό, στα πρωταρχικά πειράματα χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο διάλυμα γλυκόζης συγκέντρωσης 10 g/L, ενώ ο μεταβαλλόμενος παράγοντας ήταν η θερμοκρασία, η οποία κυμάνθηκε εντός του εύρους 22-35 οC. Και τα τρία στελέχη, PC_A2, PP_D3, MD_F1, αναπτύχτηκαν ικανοποιητικά σε όλο το εύρος των εξεταζόμενων θερμοκρασιών με τις συγκεντρώσεις της μικροβιακής μάζας να κυμαίνονται μεταξύ 3,1-5,5 g/L, 4,0-6,8 g/L και 3,3-5,8 g/L για το κάθε στέλεχος αντίστοιχα. Η συγκέντρωση του παραγόμενου λίπους κυμάνθηκε μεταξύ 0,62-1,71 g/L για το στέλεχος PC_A2, 0,7-1,94 g/L για το στέλεχος PP_D3 και 0,73-2,05 g/L για το στέλεχος MD_F1. Τη μέγιστη συγκέντρωση παραγόμενου λίπους (2,05 g/L) παρουσίασε το στέλεχος MD_F1 κατά την καλλιέργειά του στους 22 οC, το οποίο και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Άλλα παραγόμενα μεταβολικά προϊόντα που εντοπίστηκαν στο τέλος της ζύμωσης ήταν η αιθανόλη και η αραβιτόλη, η συσσώρευση των οποίων παρουσιάστηκε στις υψηλότερες θερμοκρασίες των 32 και 35 oC. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, επιλέχθηκε το στέλεχος που παρουσίασε την μεγαλύτερη δυνατότητα λιποσυσσώρευσης με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα, και πραγματοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός με τη βοήθεια λογισμικού με στόχο τον προσδιορισμό των συνθηκών που επηρεάζουν τη συγκέντρωση του μικροβιακού λίπους, της αιθανόλης και της αραβιτόλης, καθώς και την μεταξύ τους σχέση. Ένα 32 κεντρικό σύνθετο σχέδιο (CCD) αναπτύχθηκε έτσι ώστε να εισάγει τετραγωνικούς όρους, και ως εκ τούτου, να επιτρέψει την εκτίμηση της καμπυλότητας για την πρόβλεψη της συγκέντρωσης παραγόμενου μικροβιακού λίπους αλλά και του λόγου αραβιτόλη/αιθανόλη. Όσον αφορά το παραγόμενο μικροβιακό λίπος, σύμφωνα με τα αποτελέσματα του μοντέλου φαίνεται ότι οι χαμηλότερες τιμές θερμοκρασίας (< 28 οC) οδηγούν σε μειωμένη συγκέντρωση λίπους για το σύνολο του εύρους των τιμών της αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων. Ωστόσο η αξιολόγηση της σημαντικότητας του μοντέλου μέσω του F-test καθώς και οι πολύ χαμηλοί συντελεστές R2 και adj R2 υπέδειξαν ότι το μοντέλο αποτυγχάνει να προβλέψει σωστά τις βέλτιστες τιμές θερμοκρασίας και αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων που απαιτούνται για την βέλτιστη παραγωγή μικροβιακού λίπους. Σχετικά με το λόγο αραβιτόλη/αιθανόλη το μοντέλο κρίθηκε σημαντικό για επίπεδο σημαντικότητας α=0,1. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του μοντέλου για αρχική συγκέντρωση σακχάρων μεταξύ 50-100 g/L σε συνδυασμό με χαμηλές θερμοκρασίες (< 24 οC), ο λόγος αραβιτόλη/αιθανόλη παρουσιάζει μείωση (τιμές ≤ 0,2) γεγονός που υποδηλώνει την αυξημένη παραγωγή αιθανόλης έναντι της αραβιτόλης. Επιπλέον, σε όλο το εύρος των θερμοκρασιών, για αρχική συγκέντρωση σακχάρων έως 40 g/L ή μεγαλύτερη από 100 g/L, υπάρχει αύξηση του λόγου αραβιτόλη/αιθανόλη σε τιμές μεγαλύτερες του 0,2. Συγκεκριμένα, οι βέλτιστες τιμές των παραμέτρων σύμφωνα με τις προβλέψεις του μοντέλου, βρέθηκαν 33,1 οC και 16,9 g/L αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων, οι οποίες αντιστοιχούν σε λόγο αραβιτόλη/αιθανόλη ίσο με 0,68. Όσον αφορά τους παράγοντες που επηρεάζουν περισσότερο το λόγο παραγόμενη αραβιτόλη / παραγόμενη αιθανόλη, η αρχική συγκέντρωση των σακχάρων στο μέσο της καλλιέργειας παρουσίασε τη σημαντικότερη επίδραση, ενώ η αμέσως επόμενη σημαντικότερη επίδραση ασκείται από την θερμοκρασία.

The aim of the present MSc dissertation was to investigate the potential production of microbial oil from three newly isolated yeast strains, PC_A2, PP_D3 and MD_F1, which have previously shown evidence of lipid accumulation, and the selection of the most suitable strain for further study to evaluate the optimal parameters influencing the production of microbial oil during fermentation. Furthermore, the production of other metabolic products was also investigated. Preliminary fermentations were carried out at initial glucose concentration of 10 g/L, while temperature was varied in the range of 22 to 35 oC. All three strains grew satisfactorily in the entire range of the examined temperatures, with the total dry weights ranging between 3.1-5.5 g /L, 4.0-6.8 g /L and 3.3 to 5 .8 g /L for the strains PC_A2, PP_D3 and MD_F1, respectively. The concentration of the obtained single cell oil ranged between 0,62-1,71 g/L for strain PC_A2, 0,7-1,94 g/L for strain PP_D3 and 0,73-2,05 g/L for strain MD_F1. Yeast strain MD_F1, which was selected for further study, produced the highest concentration of single cell oil (2,05 g/L), when cultivated at 22 ° C. Other metabolic products obtained at the end of the fermentation were ethanol and arabitol, the accumulation of which occurred at higher temperatures of 32 and 35 oC. In the second part of the study, the yeast strain which presented the greatest potential to produce single cell oil was selected and an experimental design was developed to identify the conditions that affect the production of microbial oil, ethanol and arabitol, as well as the relationship between them. A 32 central composite design (CCD) was developed so as to introduce quadratic terms, and hence, allow the estimation of curvature for the prediction of the lipid concentration and the arabitol/ethanol ratio. The results obtained concerning the microbial oil production showed that lower temperatures (< 28 °C) led to reduced oil concentration for the entire range of the initial concentration of sugars. However, the significance of the model assessed via the F-test, as well as the very low values of R2 and R2 adj demonstrated that the model fails to predict correctly the optimum temperature and the initial concentration of sugars required for optimal production of microbial oil. Concerning the arabitol/ethanol ratio, the model was found significant for level of significance α equal to 0.1. According to the results, for initial concentrations of sugars between 50-100 g/L in combination with low temperatures (< 24 ° C), the arabitol/ethanol ratio was decreased (values ≤ 0.2) suggesting increased production of ethanol over arabitol. Moreover, increase of the arabitol/ethanol ratio was observed in the entire range of temperature for initial concentration of sugars up to 40 g/L or higher than 100 g/L, at values higher than 0.2. Specifically, the optimum values for the examined parameters according to the model’s estimations were 33,1 οC and 16,9 g/L of initial sugar concentration, which correspond to a ratio of arabitol/ethanol equal to 0,68. Regarding the most important factors that influence the arabitol/ethanol ratio, the initial concentration of sugars is the most important parameter followed by temperature.