Δυαδικό σύστημα άμυνας ολευρωπαΐνης/β-γλυκοσιδάσης της ελιάς και ομοιόσταση μέσα στο κύτταρο

Abstract

Η ολευρωπαΐνη είναι το επικρατέστερο σεκοϊριδοειδές στην ελιά (Olea europaea), το οποίο εμπλέκεται σε ένα δυαδικό σύστημα άμυνας. Αυτό αποτελείται από μια β-γλυκοσιδάση που απογλυκοζυλιώνει την ολευρωπαΐνη και παράγει ένα τοξικό άγλυκο μόριο με δομή παρόμοια της γλουταραλδεΰδης. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν διάφορα χαρακτηριστικά του ενζύμου OeGLU που κωδικοποιεί για μια αμυντική β-γλυκοσιδάση εξειδικευμένη ως προς την ολευρωπαΐνη. Η ολευρωπαΐνη στην γλυκοζιλιωμένη αδρανή της μορφή βρίσκεται, βάσει βιβλιογραφίας, αποθηκευμένη στο χυμοτόπιο των κυττάρων της ελιάς. Έχει βρεθεί ότι η OeGLU έχει διακριτή υποκυτταρική τοποθέτηση στον πυρήνα των κυττάρων, υποστηρίζοντας έτσι την υπόθεση του δυαδικού συστήματος άμυνας. Στην συγκεκριμένη διπλωματική εργασία έγινε διαγραφή του NLS (Nuclear Localization Signal), με αποτέλεσμα το μετάλλαγμα της OeGLU σε σύντηξη με το γονίδιο αναφοράς YFP να τοποθετείται πλέον στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του ετερόλογου συστήματος του φυτού Nicotiana bethmamiana, επιβεβαιώνοντας την in silico ανάλυση. Εν συνεχεία, μελετήθηκε η δυνατότητα των μονομερών του ενζύμου να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους μέσω της τεχνικής BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation). Η τεχνική απέδειξε in vivο ότι τα μονομερή του ενζύμου OeGLU αλληλεπιδρούν μεταξύ τους, με αποτέλεσμα τα δύο κομμάτια του GFP των δυαδικών φορέων να έρχονται πολύ κοντά ώστε να ανιχνεύεται φθορισμός στον πυρήνα. Καταληκτικά, χρησιμοποιώντας επίσης το ετερόλογο σύστημα έκφρασης Nicotiana benthamiana, έγινε μια προσεγγιστική προσπάθεια προσδιορισμού της δράσης του δυαδικού συστήματος άμυνας Ολευρωπαΐνης/OeGLU in vivo. Απώτερος στόχος ήταν να εξεταστεί η πιθανότητα η άγλυκη μορφή της ολευρωπαΐνης να λειτουργεί ως σινιάλο απόκρισης για την ενεργοποίηση της άμυνας του φυτού. Ύστερα από την επαφή ενζύμου υποστρώματος, ακολούθησε ανίχνευση της αύξησης της έκφρασης γονιδίων που επάγονται από την αντίδραση υπερευαισθησίας (HR) ή σχετίζονται με προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (PCD), μέσω της μεθόδου του ημιποσοτικού RT-PCR (semi-quantitative RT- PCR). Η προσπάθεια προσδιορισμού ήταν ανεπιτυχής υποδηλώνοντας την ανάγκη τελειοποίησης της μεθόδου

« The oleuropein/b-glucosidase dual-defense system of Olea europaea and homeostasis within the cell» Oleuropein, the major secoiridoid compound in olive tree (Olea europaea), is involved in a sophisticated two-component defense system, comprising a β-glucosidase enzyme that activates oleuropein into a toxic glutaraldehyde-like structure. The experimental work conducted in the present thesis reports various features of the enzyme OeGLU, which encodes for a defensive b-glucosidase specific for oleuropein. According to the pre-existing literature, when oleuropein is glycosylated becomes inactive and is located in vacuoles. It has been found that OeGLU has distinct subcellular localization in the nucleus of plant cells, which supports the hypothesis of the dual defense system. As part of this project, the NLS (Nuclear Localization Signal) was deleted and therefore, the resulted OeGLU mutant in fusion with the reporter gene YFP is now localized in the cytoplasm of the leaf epidermal cells in the heterologous expression system of Nicotiana bethmamiana, confirming the in silico analysis. Following these results, the BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) method was used to study whether the enzyme’s monomers interact with each other. Indeed, the technique proved this hypothesis in vivo, by showing that the interaction between the monomers of OeGLU brings also the two GFP fragments in the two different binary vectors close with each other, resulting in the detection of fluorescence signal inside the cell’s nucleus. As a final step of the present thesis, the heterologous system of N. benthamiana was used once again in order to test a different approach regarding the action of the dual defense system of OeGLU/Oleuropein. The overall aim was to examine whether the aglycone of Oleuropein can actually act as a signal response towards the plant’s defense activation system. The enzyme and the substrate were brought in contact and afterwards, the method of semi-quantitative RT-PCR was used in an attempt to detect gene expression induced either by the hypersensitive response (HR) or associated to programmed cell death (PCD). Unfortunately, the attempt was unsuccessful, suggesting that further improvement of this method is needed.