Καθορισμός της μοίρας της πρωτεΐνης LEFKOTHEA από το 26S-πρωτεάσωμα στο Arabidopsis

Abstract

Το τμήμα (PORR Plant Organelle RNA Recognition) αποτελεί κομμάτι πολλών συγκεκριμένων φυτικών πρωτεϊνών των οποίων η λειτουργία παραμένει ακαθόριστη μέχρι και σήμερα. Το πλέον πιθανό σενάριο είναι πως αυτές οι πρωτεΐνες παίζουν έναν σημαντικό ρόλο στην διαδικασία του ματίσματος των ιντρονίων της ομάδας ΙΙ των γονιδίων που κωδικοποιούνται από τον χλωροπλάστη. Η LEFKOTHEA1 (LEFKO1) αποτελεί μία πρωτείνη που κωδικοποιείται από τον πυρήνα και είναι μέλος της οικογένειας PORR. Βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, προέβλεψε πως η LEFKO1 περιέχει ένα πεπτίδιο-οδηγό το οποίο ευθύνεται για την στόχευση της πρωτείνης στον χλωροπλάστη, καθώς και δύο μοτίβα τα οποία συνδέονται με την είσοδο(NLS) και την έξοδο(NES) της πρωτείνης από τον πυρήνα. Έχουμε χαρακτηρίσει το lefko1-1 το οποίο αποτελεί ένα μετάλλαγμα EMS το οποίο χαρακτηρίζεται από μία αμινοξική υποκατάσταση της Γλυκίνης από Ασπαρτικό οξύ στο τμήμα του NES.Η μετάλλαξη αυτή διαταράσσει την πρωτεϊνική ομοιόσταση, αυξάνοντας την έξοδο της πρωτείνης από τον πυρήνα. Το μετάλλαγμα lefko1-1 έχει λευκές κοτυληδόνες και κοντή πρωτογενή ρίζα, ενώ τοT-DNA αλληλόμορφό του lefko1-2 το οποίο έχει πλήρη έλλειψη λειτουργικότητας ,σε ομοζυγωτία διακρίνεται από την παύση της ανάπτυξης του εμβρύου στο καρδιόσχημο στάδιο. Μικροσκοπική ανάλυση κατασκευών του γονιδίου LEFKO1 συντηγμένου με τη πρωτείνη-μάρτυρα YFP, επιβεβαίωσε την δυαδική τοποθέτηση της πρωτείνης και στον χλωροπλάστη και στον πυρήνα. Ο φαινότυπος του lefkothea αποτελεί αποτέλεσμα της διαταραγμένης ισορροπίας της πρωτείνης στον πυρήνα, εξαιτίας της αυξημένης εξόδου της από τον πυρήνα. Συνεπώς, η εκδοχή της πρωτείνης LEFKOTHEA1 που στερείται το πεπτίδιο-οδηγό στο αμινο-τελικό(N-terminus) άκρο συμπληρώνει τον φαινότυπο του lefkothea και επισημαίνει τον σημαντικότατο ρόλο της πρωτείνης στον πυρήνα. Ενώ η απεικόνιση σε ζωντανά, παροδικώς μετασχηματισμένα κύτταρα καπνού, κατασκευών του γονιδίου LEFKO1 όπου περιέχεται συντηγμένο το γονίδιο που κωδικοποιεί για την πρωτείνη μάρτυρα YFP επιβεβαιώνει την δυαδική τοποθέτηση της πρωτείνης στα δύο υποκυτταρικά διαμερίσματα, σε σταθερώς μετασχηματισμένα φυτά Arabidopsis, η ανίχνευση της πρωτείνης στον πυρήνα καθίσταται εφικτή μόνο μετά την εφαρμογή του αναστολέα MG-132 του 26S πρωτεασώματος . Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, θα μπορούσε να υποστηριχθεί πως η ελλειμματική διανομή της LEFKOTHEA1 μεταξύ του πυρήνα και του χλωροπλάστη, συνδέεται άμεσα με την αποδόμησή της από το 26S πρωτεάσωμα. Σε συνδυασμό με αυτές τις παρατηρήσεις, in silico ανάλυση προέβλεψε πως η LEFKOTHEA1 αποτελείται από 2 Destruction Boxes (D-Boxes) τα οποία και ευθύνονται για την αναγνώριση της πρωτείνης από το μονοπάτι της Ουμπικουιτίνης/26S πρωτεασώματος .Σκοπό αυτής της μελέτης αποτελεί η αλλαγή της ισορροπίας της LEFKOTHEA1 ανάμεσα τον πυρήνα και τον χλωροπλάστη με το να εμποδιστεί η αποδόμησή της από το 26S πρωτεάσωμα. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, προετοιμάστηκαν κατασκευές του γονιδίου LEFKOTHEA1 με το γονίδιο YFP, οι οποίες έφεραν μεταλλάξεις στις ακολουθίες των δύο D-Boxes και συγκεκριμένα αμινοξικές αντικαταστάσεις. Αυτές οι κατασκευές έφεραν επίσης τον επίτοπο FLAG στο καρβόξυ-τελικό τους άκρο για πειράματα co-IP. Στόχος είναι να διαλευκανθεί το εάν η μη- διαταραγμένη διανομή της LEFKOTHEA1 απαιτείται για την εμβρυογένεση και να αποκαλύψει τα μονοπάτια επικοινωνίας μεταξύ του πυρήνα και του χλωροπλάστη, τα οποία και έχουν ξεχωριστή προέλευση, που ελέγχουν την βιογένεση του χλωροπλάστη και την λειτουργία του.

The PORR (Plant Organelle RNA Recognition) domain is a component of plant specific proteins whose function remains elusive as yet. These proteins most likely play a key role in the splicing process of group II introns of chloroplast encoded genes. LEFKOTHEA1 (LEFKO1) is a nuclear encoded protein that is a member of the PORR class. Bioinformatics analysis predicted that LEFKO1 contains a putative transit peptide responsible for protein targeting to the chloroplast and two motifs associated with nuclear localization (NLS) and export (NES). We have characterized lefko1-1 an EMS mutant allele that carries an amino acid substitution of Glycine to Aspartic acid at NES proximity. This mutation disturbs protein homeostasis by enhancing LEFKO nuclear export. The lefko1-1 mutant has white (Greek: lefko) cotyledons and short primary roots, while the total loss of function lefko 1-2 T-DNA allele causes embryogenesis arrest upon transition from the globular to the heartstage. Microscopic analysis of LEFKO1 gene constructs fused to YFP confirmed the dual targeting properties of LEFKO1 to both chloroplasts nucleoids and nucleus foci. The lefkothea phenotype results from disturbed equilibrium of the protein in the nucleus due to enhanced protein export. Consequently, the truncated version of LEFKOTHEA1 protein missing the transit peptide at the N-terminus complements the lefkothea phenotype and highlights the crucial role of LEFKOTHEA1 in the nucleus. While live cell imaging of LEFKO1 gene fusion constructs with YFP confirmed protein targeting upon transient expression in tobacco leaves to two subcellular compartments, the protein is detected in the nucleus of stable transformed Arabidopsis plants only when the 26S proteasome inhibitor MG-132 is applied. Taken together these results support that the eclipsed protein distribution of LEFKOTHEA1 between the nucleus and chloroplast is associated with selective protein turnover by the 26S proteasome. In line with these observations, in silico analysis predicted that LEFKOTHEA1 bears two Destruction Boxes (D-Boxes) responsible for protein recognition by the ubiquitin/26S proteolytic system. The aim of this work is to change the equilibrium of LEFKOTHEA1 between the nucleus and the chloroplast by inhibiting protein turnover through the 26S proteasome. To accomplish this task LEFKOTHEA1 gene fusion constructs with the YFP reporter gene were prepared that carry mutations through amino acid substitutions of the two D-Boxes. These transgenes also carry the FLAG epitope at the C-terminus for co-IP experiments. The scope is to clarify whether the non-eclipsed distribution of LEFKOTHEA1 is crucial for embryogenesis and unravel the communication pathways between the nucleus and chloroplast, which have distinct origin, that control chloroplast biogenesis and function