Η ATP-εξαρτώμενη Lon πρωτεάση είναι εξαιρετικά συντηρημένη σε όλα τα βασίλεια των ζώντων οργανισμών και κατέχει κεντρικό ρόλο στον ποιοτικό έλεγχο των πρωτεϊνών, ο οποίος εξασφαλίζει την πρωτεόσταση του κυττάρου. Η οικογένεια Lon του Arabidopsis αποτελείται από τέσσερα μέλη που παράγουν διακριτές πρωτεϊνικές ισομορφές και τοποθετούνται κατά περίπτωση στα διάφορα υποκυτταρικά οργανίδια. Το AtLon3 αποτελεί το μοναδικό μέλος που δεν έχει μελετηθεί εκτενώς, καθώς θεωρούταν μέχρι προσφάτως ψευδογονίδιο. Παρόλα αυτά, νέα δεδομένα ανάλυσης μικροσυστοιχιών υπέδειξαν υψηλά επίπεδα της έκφρασής του στα σπερματικά κύτταρα της γύρης του Arabidopsis και η ύπαρξη του μεταγραφήματος στη γύρη επιβεβαιώθηκε σε προηγούμενη πειραματική μελέτη.
Στην παρούσα μεταπτυχιακή μελέτη διερευνήθηκε η δυναμική του προτύπου έκφρασης και υποκυτταρικής τοποθέτησης του γονιδίου AtLon3. Βιοπληροφορική ανάλυση υπέδειξε δυαδικό σινιάλο στόχευσης σε μιτοχόνδρια και χλωροπλάστες, αλλά και την ύπαρξη ενός NLS. Η παροδική έκφρασή στο ετερόλογο σύστημα Nicotiana benthamiana μίας σειράς κατασκευών που διαφοροποιούνται στο 5’ άκρο, έδειξε ότι σε κάθε περίπτωση η AtLon3 τοποθετείται στα μιτοχόνδρια του κυττάρου, ενώ όταν αφαιρείται η αμινοτελική περιοχή παρουσιάζει δυαδική στόχευση στον πυρήνα και τα μιτοχόνδρια. Η ανάλυση των μεταγραφημάτων AtLon3 μετά από παροδική έκφραση του γονιδίου υπό τον έλεγχο του ενδογενούς υποκινητή του, έδειξε την απουσία του 1ου εξωνίου και την ύπαρξη δύο εναλλακτικών μεταγραφημάτων, το ένα εκ των οποίων αλλάζει αναγνωστικό πλαίσιο και χάνει την περιοχή του NLS.
Συνδυάζοντας τα προαναφερθέντα αποτελέσματα, διαπιστώθηκε ότι η μετάφραση της πρωτεΐνης δεν εξαρτάται από τα AUGs του υποθετικού 1ου εξωνίου, καθώς αυτό δεν αποτελεί κωδική περιοχή, ενώ παράλληλα η διαγραφή τους δεν επηρεάζει την παραγωγή και τη στόχευση της AtLon3 στα μιτοχόνδρια. Ανέκυψαν δύο υποθέσεις για την έναρξη της πρωτεΐνης: α) η πιθανότητα εναλλακτικού κωδικονίου έναρξης (non-AUG) στην περιοχή του 2ου εξωνίου και β) η πιθανότητα η μετάφραση να ξεκινάει από το επόμενο AUG στο τέλος του 3ου εξωνίου, η περιοχή που προηγείται να αποτελεί 5’UTR και το μάτισμα του εσωνίου να συμβάλει στη σταθεροποίηση του μηνύματος. Η δυαδική στόχευση στα μιτοχόνδρια και τον πυρήνα φαίνεται να σχετίζεται με την απουσία του εκτεταμένου σε μήκος μιτοχονδριακού σινιάλου στόχευσης (N-terminal), που θα μπορούσε να επηρεάζει την αναγνώριση του NLS από τον πυρήνα. Τόσο τα εναλλακτικά μεταγραφήματα όσο και η τοποθέτηση της πρωτεΐνης στον πυρήνα δεν έχουν αποσαφηνιστεί, αλλά θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ιδιαιτερότητα των σπερματικών κυττάρων, που αποτελούν ουσιαστικά δύο μεγάλους πυρήνες.
The ATP-dependent Lon protease is highly conserved across the kingdoms of all living organisms and holds a vital role in the protein quality control mechanism, which maintains the cell’s proteostasis. The Lon gene family of Arabidopsis consists of four members that produce distinct protein isoforms localized in several organelles. AtLon3 is the only family member that has not been extensively studied, as it was thought until recently to be a pseudogene. Nevertheless, there are new microarray data showing high expression levels of AtLon3 in Arabidopsis pollen sperm cells, whereas the transcript’s presence in pollen has been identified in a previous experimental study.
This Master thesis investigates the dynamics of the expression pattern and the subcellular localization of the AtLon3 gene. Bioinformatics analysis of AtLon3 gene predicted the presence of an ambiguous presequence for dual targeting in mitochondria and chloroplasts, as well as the presence of NLS. Transient expression of a series of constructs that differ in the 5’ prime in Nicotiana benthamiana, showed that the AtLon3 protein is localized consistently in mitochondria except of when it misses the N-terminal, in which case it exhibits dual targeting in nucleus and mitochondria. The analysis of AtLon3 transcripts following the gene’s transient expression driven by its native promoter, revealed the absence of the hypothetical 1st exon as well as the presence of two alternative transcripts, one of which is characterized by a reading frame turnover, resulting in the loss of the NLS sequence.
Through the combination of the abovementioned results, it was found that the translation of the protein is independent of the AUGs residing in the hypothetical 1st exon, since it does not belong in the coding region and, in parallel to that, the deletion of those AUGs affects neither the production nor the localization of AtLon3 in mitochondria. There are two hypotheses concerning the initiation of translation: a) the possibility of a non-AUG initiation codon residing within the 2nd exon and b) the possibility the initiation of translation to occur in the next AUG, which is located close to the end of the 3rd exon, whereas the region prior to the AUG is the gene’s 5’ UTR and the intron’s splicing contributes to the transcript’s stabilization. The dual-targeting in mitochondria and nucleus appears to be related to the absence of the long mitochondrial presequence (N-terminal), which could affect the recognition of the NLS by the nucleus. Both the presence of the alternative transcripts and the localization of the protein in the nucleus have not been clarified through this experimental study, but could be related to the special nature of the sperm cells, meaning that they are actually two rather big nuclei.
