Μοριακή διερεύνηση του ρόλου των αυξινών στην βιολογική αντιμετώπιση και ανθεκτικότητα των φυτών Arabidopsis thaliana εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Verticillium dahliae

Abstract

Η αδρομύκωση που προκαλείται από τον εδαφογενή φυτοπαθόγονο μύκητα Verticillium dahliae είναι δύσκολα ελεγχόμενη και ταυτόχρονα καταστροφική εξαιτίας της ικανότητας του παθογόνου να προσβάλλει τους αγγειώδεις ιστούς των φυτών και να επιβιώνει για δεκαετίες στο έδαφος. Τα τελευταία χρόνια λόγω της αδυναμίας χημικής αντιμετώπισης του μύκητα, το ενδιαφέρον για τον έλεγχο της ασθένειας επικεντρώνεται στην ανακάλυψη βιολογικών ανταγωνιστών. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος των αυξινών κατά την προσβολή των φυτών Arabidopsis thaliana από το μύκητα V. dahliae καθώς επίσης και η επίδραση τους στην βιολογική αντιμετώπιση του μύκητα με τη χρήση του ριζοβακτηρίου Paenibacillus alvei K165. Μελετήθηκαν γονίδια που εμπλέκονται στη σηματοδότηση (TIR1, AFB1, AFB3) καθώς και στη μεταφορά (AXR4) των αυξινών μέσα στο κύτταρο. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα παθογένειας κατά τα οποία φυτά A.thaliana αγρίου τύπου (Col-0) και φυτά μεταλλαγμένα στα παραπάνω προς εξέταση γονίδια, μολύνθηκαν είτε μόνο με το παθογόνο μύκητα V.dahliae είτε σε συνδυασμό με τον βιολογικό παράγοντα P. alvei K165. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε καταγραφή των συμπτωμάτων και αποτυπώθηκε το ποσοστό των ασθενών φύλλων, η συχνότητα εμφάνισης της ασθένειας και το σχετικό εμβαδό ασθενείας έτσι ώστε να υπάρξει μια ολοκληρωμένη εικόνα σχετικά με τον ρόλο αυτών των γονιδίων. Με αυτό τον τρόπο θα κατανοήσουμε το πώς συνδέονται τα συγκεκριμένα γονίδια με την μολυσματική ικανότητα του παθογόνου ή πως εμπλέκονται στην θετική επίδραση του βιολογικού παράγοντα. Έπειτα μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων PR1 και PDF1.2 που σχετίζονται με την επαγόμενη από το σαλικυλικό οξύ και το αιθυλένιο, αντίστοιχα, άμυνα των φυτών στα μεταλλαγμένα φυτά καθώς επίσης και η έκφραση των γονιδίων TIR1, AFB1, AFB3 και AXR4 σε φυτά άγριου στελέχους μετά τον εμβολιασμό μόνο του παθογόνου μύκητα ή μόνο του βιολογικού παράγοντα ή και σε συνδυασμό και των δύο, τόσο στο υπέργειο μέρος όσο και στο ριζικό σύστημα. Τέλος κρίθηκε σημαντικό να εξετασθεί κατά πόσο μεταβάλλεται η συγκέντρωση του ινδολ-3-οξικού οξέος στις προαναφερθείσες επεμβάσεις στο άγριο στέλεχος φυτών A. thaliana σε σύγκριση με τα μη μολυσμένα φυτά. Τα αποτελέσματα της εργασίας απέδειξαν ότι τα μεταλλαγμένα φυτά afb1, afb3 και axr4 ήταν ανθεκτικότερα από τα άγριου τύπου φυτά στο μύκητα V. dahliae και παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των γονιδίων PR1 και PDF1.2 υποδεικνύοντας ενεργοποίηση του αμυντικού συστήματος των φυτών. Επίσης αξίζει να αναφερθεί ότι δεν επιτεύχθηκε προστασία από τον βιολογικό παράγοντα P. alvei K165 στα μεταλλαγμένα φυτά tir1 και axr4 παρόλο που φαίνεται να ενεργοποιήθηκε ο αμυντικός μηχανισμός. Επιπλέον μελετώντας την έκφραση όλων των γονίδιων στο ριζικό σύστημα του άγριου στελέχους, όταν εφαρμόστηκε μόνο το παθογόνο, παρατηρήθηκε υπερέκφραση όλων των γονιδίων υποδεικνύοντας ότι το παθογόνο επεμβαίνει στη σηματοδότηση καθώς και στη μεταφορά της αυξίνης μέσα στο φυτό. Επιπρόσθετα όσον αφορά το βακτήριο P.alvei K165 φαίνεται πώς διαφορετικά επεμβαίνει στην έκφραση όλων των προς εξέταση γονιδίων, όταν εφαρμόζεται μόνο του ή σε συνδυασμό με το παθογόνο. Τέλος οι παραπάνω παρατηρήσεις σε συνδυασμό με τη μελέτη της συγκέντρωσης του ινδολ-3-οξικού οξέος, επιβεβαιώνουν ότι το παθογόνο είναι ικανό να διαχειρίζεται τη σηματοδότηση και τη μεταφορά της αυξίνης προς όφελος του.

In the last decades, due to the absence of chemical disease management of V. dahliae, the interest for the control of the pathogen focuses on the discovery of biological antagonists such as the bacterial strain Paenibacillus alvei K165. Taking into consideration that biocontrol interactions between soilborne fungal pathogens and their hosts have received little attention, it is essential to find out the molecular interaction of this rhizobacterium, K165, with A. thaliana and as a consequence to derive more information about the pathogenicity mechanism of V. dahliae. For this purpose, in the current study, the role of auxins during the attack of plants, A. thaliana, by this pathogen as well as their impact on the biological control of the fungus by P. alvei K165 was investigated. Genes involved in auxin signaling (TIR1, AFB1, AFB3) and transporting (AXR4) inside the plant cell were studied. In this way, we will comprehend how these specific genes are connected with the virulence of this pathogen or how they are involved in the positive effect of the biocontrol agent. It was proved that the mutant plants afb1, afb3 and axr4 were more resistant than wild type. Also an increased expression of PR1 and PDF1.2 was observed, indicating activation of the plant immune system. Moreover, it is worth mentioning that K165 did not protect the mutant plants tir1 and axr4, despite the fact that defense mechanisms seem to have been activated. Furthermore, by studying the expression of all genes (TIR1, AFB1, AFB3 and AXR4) in the root system of the wild plants, when only the pathogen was inoculated, it was observed over expression of all these genes, indicating that the pathogen intervenes in the signaling and transporting pathways of the auxin in plants. As far as P. alvei K165 is concerned, it seems that intervenes in the expression of all genes, in a way that depends on the absence or presence of the pathogen. To sum up, the above remarks in connection with the study of indole-3-acetic acid accumulation upon V. dahliae infection, it was confirmed that the pathogen is able to manipulate the signaling and transporting pathway of auxin in plant for its benefit.