Αξιολόγηση της ανθεκτικότητας υβριδίων ηλίανθου στις ιμιδαζολινόνες και διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού της ανθεκτικότητάς τους

Abstract

Τα ζιζανιοκτόνα της ομάδας των ιμιδαζολινονών έχουν στοχευμένο τρόπο δράσης κι αναστέλλoυν τη λειτουργία του ενζύμου συνθετάση του ακετοϋδροξικού οξέος (acetohydroxyacid synthase, AHAS) ή συνθετάση του οξικογαλακτικού οξεός (acetolactate synthase, ALS). Το AHAS καταλύει τη βιοσύνθεση των αμινοξέων βαλίνης, λευκίνης και ισολευκίνης, τα οποία είναι απαραίτητα για την κυτταροδιαίρεση και την ανάπτυξη των φυτών. Η τεχνολογία Clearfield ή Ιmisun του ηλίανθου βασίζεται σε μία φυσική μετάλλαξη στο ενεργό κέντρο του AHAS, στην οποία η αλανίνη αντικαθίσταται από την βαλίνη στη θέση 205 (Ala205Val). Σκοπός της εργασίας ήταν η αξιολόγηση της ανθεκτικότητας υβριδίων ηλίανθου στις ιμιδαζολινόνες. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων HaAHASl1, HaAHASl2, HaAHASl3 που κωδικοποιούν την καταλυτική υπομονάδα του AHAS και η πιθανή συσχέτισή τους με το μοριακό μηχανισμό της ανθεκτικότητας. Για το σκοπό αυτό ένα ευαίσθητο υβρίδιο (S1) και δύο Clearfield υβρίδια (R2, R3), φυτεύτηκαν σε φυτοδοχεία έως το στάδιο του 2-3ου ζεύγους φύλλων, όπου τα φυτά (12/υβρίδιο/επέμβαση/επανάληψη) δέχτηκαν επεμβάσεις με ψεκαστικό διάλυμα που περιείχε είτε 400μg imazamox/ml ζιζανιοκτόνου είτε 1200μg/ml, ενώ σαν μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν φυτά, τα οποία είχαν ψεκαστεί με νερό. Τα υβρίδια αξιολογήθηκαν μετά από 7, 14 και 21 ημέρες από τις επεμβάσεις, σε μία κλίμακα 0 (υγιές) έως 5 (νεκρό φυτό), σύμφωνα με τα φυτοτοξικά συμπτώματα που παρουσίασαν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το στατιστικό πρόγραμμα JMP®8. Παράλληλα προσδιορίστηκε η μέση αποτελεσματική δόση (ED50) του ζιζανιοκτόνου για το κάθε υβρίδιο. Για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, 36 ώρες μετά τις επεμβάσεις, συλλέχθηκε φυλλικός ιστός από 10 φυτά/υβρίδιο/επανάληψη, απομονώθηκε RNA και πραγματοποιήθηκε σύνθεση του cDNA. Στη συνέχεια έγινε βελτιστοποίηση των συνθηκών της PCR και ακολούθησε σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων με τη χρήση της RTqPCR. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού REST©. Σύμφωνα με την φαινοτυπική αξιολόγηση, τα υβρίδια R2 και R3 παρουσίασαν ανθεκτικότητα στην δόση των 400μg/ml ζιζανιοκτόνου ενώ ευαισθησία στην δόση των 1200μg imazamox/ml ζιζανιοκτόνου. Το ευαίσθητο υβρίδιο S1 παρουσίασε ευαισθησία και στις δύο συγκεντρώσεις ζιζανιοκτόνου. Η αξιολόγηση αυτή επιβεβαιώθηκε και με το ED50. Σύμφωνα με την στατιστική ανάλυση των δεδομένων στο JMP®8, η αλληλεπίδραση μεταξύ υβριδίων και επεμβάσεων δεν ήταν σημαντική, ενώ σημαντική ήταν η επίδραση του γονοτύπου των υβριδίων αλλά και των επεμβάσεων την 7η ημέρα καθώς και την 21η παρατηρήσεων. Όσον αφορά τη γονιδιακή έκφραση, το HaAHASl1 παρουσίασε σχεδόν 3 φορές αύξηση στα S1 και R3 υβρίδια μετά από τις επεμβάσεις με το imazamox, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Tο γονίδιο HaAHASl2 παρουσίασε αξιοσημείωτη επαγωγή στο R3 υβρίδιο και στις δύο συγκεντρώσεις του ζιζανιοκτόνου. Τέλος, η έκφραση του γονιδίου HaAHASl3 δεν παρουσίασε σημαντική μεταβολή σε κανένα από τα υβρίδια σε όλες τις επεμβάσεις. Το R2 υβρίδιο παρουσίασε μειωμένη έκφραση των γονιδίων HaAHASl1 και HaAHASl2 μετά από τις επεμβάσεις με το ζιζανιοκτόνο. Συμπερασματικά, τα υβρίδια R2 και R3 θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως ανθεκτικά στη δραστική ουσία imazamox. Η ανθεκτικότητα φαίνεται να είναι δοσοεξαρτώμενη και με πιθανή επίδραση του παράγοντα περιβάλλον. Τα γονίδια HaAHASl1 και HaAHASl2 πιθανώς να σχετίζονται με τον μηχανισμό της ανθεκτικότητας του ηλίανθου στις ιμιδαζολινόνες.

The herbicides of the imidazolinone family inhibit the action of acetohydroxyacid synthase (AHAS) or acetolactate synthase (ALS) enzyme and are associated with target-site resistance. AHAS catalyzes the biosynthesis of the amino acids valine, leucine and isoleucine, which are necessary for protein synthesis, cell division proper plant development. Clearfield technology or Imisun in sunflower involves the development of imidazolinone-resistant cultivars or hybrids and is based on a natural mutation in the active site of the AHAS enzyme. In particular, a substitution of an alanine by a valine at amino acid 205 of the enzyme (Ala205Val) confers resistance to imidazolinones. The purpose of this study was (i) the evaluation of resistance of Clearfield sunflower hybrids to imidazolinones, and (ii) the analysis of expression of the HaAHASl1, HaAHASl2, HaAHASl3 genes, which code for the catalytic subunit of AHAS, and its putative involvement with the molecular mechanism of resistance. The sensible hybrid (S1) and the Clearfield hybrids (R2, R3), were planted in pots with substrate, in the greenhouse. The plants (12hybrids/treatment/repeat) were treated with sprayed solution which contained 400μg imazamox/ml herbicide and 1200μg/ml at the stage of 2-3 pair of leaves. Control plants were sprayed with tap water. Visual estimates were recorded at 7, 14 and 21 days after treatments, on a scale 0 (healthy) – 5(dead plants) based on phytotoxic symptoms. Statistical analysis was performed with the JMP®8 program. Furthermore, the effective dose (ED50) of herbicide was determined for each hybrid. Regarding the analysis of gene expression, leaf tissue was collected from 10plants/hybrids/repeat, 36 hours after treatment for RNA isolation and subsequent cDNA synthesis. PCR conditions were optimized with end point PCR and quantitative gene expression analysis was performed with Real Time quantitative PCR. The data were analyzed with the REST© program. According to the phenotypic evaluation, the R2 and R3 hybrids presented resistance to the dose of 400μg imazamox/ml herbicide, whereas they exhibited susceptibility at the dose of 1200μg/ml. The susceptible hybrid S1 displayed susceptibility at both doses. This evaluation was confirmed by the ED50. The JMP’s statistical analysis showed that the interaction between hybrids and treatments was not significant, in relation to the effect of hybrids genotype and the treatment’s on 7th and 21st day. Regarding gene expression, HaAHASl1 was increased approximately 3 times fold in S1 and R3 hybrids after imazamox treatments. The HaAHASl2 gene showed remarkable induction in the R3 hybrid in both treatments. The gene HaAHASl3 did not show any significant change in any hybrid and at any treatment. All three genes exhibited decreased expression in the R2 hybrid as compared to the untreated control. In conclusion, the R2 and R3 hybrids could be characterized as resistant. The resistance is dose-dependent and a possible factor of reaction is the environment. The induction of the HaAHASl1 and HaAHASl2 genes suggests an association of gene expression with the molecular mechanism of resistance of sunflower to imidazolinones.