Μελέτη της βιοδραστικότητας εκχυλισμάτων μυκηλίου και καρποσωμάτων μυκήτων του γένους Ganoderma

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της βιοδραστικότητας εκχυλισμάτων μυκηλίου και καρποσωμάτων μυκήτων του γένους Ganoderma και είδους adspersum, resinaceum, applanatum και lucidum, έπειτα από υγρή και στερεή ζύμωσή τους. Αρχικά έγινε υγρή ζύμωση προκειμένου να ληφθούν μυκήλια. Κατά την συγκριτική τους αξιολόγηση εξετάστηκε η ικανότητά τους να καταναλώνουν ως πηγή άνθρακα την γλυκόζη, η παραγωγή μυκηλιακής μάζας, εξω/ ενδοπολυσακχαριτών και λιπιδίων. Ο χρόνος που ολοκληρώθηκε η καλλιέργεια ήταν σημαντικά μικρότερος για τα G. applanatum, G. resinaseum και G. adspersum (~13 ημέρες) από ό,τι για τα G. lucidum (27 ημέρες), αν και στο τελευταίο η κατανάλωση γλυκόζης ήταν ολοκληρωτική. Όλοι οι μύκητες παρήγαγαν ικανοποιητική ποσότητα βιομάζας (μέγιστη τιμή 18,8 g/l στο G. applanatum έως 12 g/l σε G. resinaseum και G. adspersum), ενώ ως ικανοποιητική εκτιμήθηκε και η παραγόμενη ποσότητα των εξωπολυσακχαριτών (~0,5 g/l), ενώ στα αναμενόμενα όρια ήταν η ποσότητα των λιπιδίων (3-7 % κ.β.). Ιδιαίτερα υψηλές ήταν οι τιμές των ενδοπολυσακχαριτών των μυκηλίων των G. applanatum, G. resinaseum και G. adspersum (65-80% κ.β.). Επίσης, έπειτα από μελέτη της σύστασης των ενδοπολυσακχαριτών και των λιπιδίων διαπιστώθηκε ότι η γλυκόζη ήταν το κύριο απλό σάκχαρο των ενδοπολυσακχαριτών, ενώ το ∆9,12C18:2 (λινελαϊκό οξύ) ήταν το λιπαρό οξύ που εντοπίστηκε σε μεγαλύτερη ποσότητα στα μυκήλια των υπό εξέταση μακρομυκήτων. Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ζύμωση στερεής κατάστασης και η συγκριτική αξιολόγηση των μακρομυκήτων βασίστηκε στην ικανότητά τους να αξιοποιούν τα λιγνοκυτταρινούχα υποστρώματα οξιάς και βελανιδιάς. Από τα 4 είδη, μόνο τα G. adspersum και G. resinaceum έδωσαν ώριμες καρποφορίες και στα δύο υποστρώματα, 128 ημέρες μετά τον εμβολιασμό τους. Σύμφωνα με τις τιμές της % Απόδοσης (Α% - g νωπού βάρους μανιταριών/g νωπού βάρους υποστρώματος) και της % Βιολογικής Αποδοτικότητας (ΒΑ% - g νωπού βάρους μανιταριών/g ξηρού βάρους υποστρώματος) διαπιστώθηκε ότι η βελανιδιά ήταν το καλύτερο υπόστρωμα καλλιέργειας, καθώς ευνόησε τα ποσοτικά (αριθμός καρποφοριών, Α%, ΒΑ%) και ποιοτικά (υγρασία, μέσο βάρος καρποφοριών) χαρακτηριστικά της καλλιέργειας, με μέγιστες τιμές 6,32 ΒΑ% και 1,23 g μέσο βάρος καρποφορίας στο G. resinaceum. Ακόμα υπολογίσθηκε η περιεκτικότητα των ενδοπολυσακχαριτών και των λιπιδίων των καρποσωμάτων από όπου και φάνηκε ότι οι πολυσακχαρίτες σε όλα τα στελέχη και υποστρώματα ήταν ~40% κ.β. και τα λιπίδια 1-1,5 % κ.β.. Έπειτα, έχοντας λάβει βιομάζα μυκηλίων και καρποσωμάτων, έγινε εκχύλισή τους με νερό σε χαμηλή (25 οC - ΨΕ) και υψηλή (100 οC - ΘΕ) θερμοκρασία. Στην τελευταία φάση, διερευνήθηκε η βιοδραστικότητα όλων των εκχυλισμάτων προσδιορίζοντας το περιεχόμενό τους σε απλές φαινόλες και τερπενοειδή, αλλά και η αντιοξειδωτική τους ικανότητα. Στα εκχυλίσματα των καρποσωμάτων που εξετάστηκαν προστέθηκε και αυτό του G. lucidum στελέχους 332, το οποίο παρασκευάστηκε όπως και τα προηγούμενα. Ο προσδιορισμός του συνολικού φαινολικού περιεχομένου των εκχυλισμάτων έγινε με βάση τη μέθοδο Folin- Ciocalteu, ενώ η ποσοτικοποίηση των συνολικών τριτερπενοειδών έγινε φωτομετρικά. Η εκτίμηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας έγινε μέσω της δέσμευσης της 1,1-διφαίνυλο-2-πικρυλο-υδράζυλο ελεύθερης ρίζας (DPPH•) και της μέτρηση της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας ορού (Total Serum Oxidizability - TSO). Από τα πειράματα που έλαβαν χώρα διαπιστώθηκε ότι τα εκχυλίσματα μυκηλίων χαμηλότερης θερμοκρασίας ήταν πιο πλούσια σε φαινόλες (415-515 mg/l) και τερπενοειδή (20,5-32,7 mg/g) σε αντίθεση με τα αντίστοιχα εκχυλίσματα υψηλότερης θερμοκρασίας, όπου το περιεχόμενο σε φαινόλες κυμάνθηκε από 155 έως 187 mg/l και σε τερπενοειδή από 7,9 έως 15,3 mg/g. Από όλα τα εξεταζόμενα εκχυλίσματα μυκηλίων αυτό που ξεχώρισε ήταν του G. resinaceum ΨΕ διότι σε αυτό εντοπίστηκε το μεγαλύτερο φορτίο σε απλές φαινόλες και τερπενοειδή. Όσον αφορά στην σύσταση των εκχυλισμάτων μυκηλίων σε φαινόλες φάνηκε ότι το p-OH-βενζοϊκό οξύ, το καφφεϊκό οξύ και η ρεσβερατρόλη ήταν οι κοινές πολυφαινόλες. Παρόμοια ήταν η τάση που εμφάνισαν τα εκχυλίσματα των καρποσωμάτων με τη διαφορά ότι το περιεχόμενό τους σε φαινόλες (153-223 mg/l για τα ΨΕ και 110-149 mg/l για τα ΘΕ) και τερπενοειδή (7,2-12,1 mg/g για τα ΨΕ και 5,3-7,3 mg/g για τα ΘΕ) ήταν μικρότερο από εκείνο των μυκηλίων. Ακόμα, συγκρίνοντας το περιεχόμενο των εκχυλισμάτων σε φαινολικά και τερπενοειδή ανά είδος και ως προς το υπόστρωμα καλλιέργειας φάνηκε ότι τα μανιτάρια που η καλλιέργεια έγινε σε 4 βελανιδιά είχαν περισσότερες φαινόλες και τερπενοειδή από τα αντίστοιχα σε οξιά. Όσον αφορά στην σύσταση των εκχυλισμάτων των καρποσωμάτων όπως αυτή προέκυψε από τη μέθοδο SIM, τα περισσότερα φαινολικά οξέα που εντοπίστηκαν ήταν η βανιλίνη, το κινναμωμικό οξύ, η τυροσόλη, το p- OH-βενζοϊκό οξύ, το βανιλικό οξύ, το πρωτοκατεχικό οξύ, το συριγκικό οξύ και λιγότερο το καφφεϊκό οξύ και η ρεσβερατρόλη. Από την ίδια μέθοδο επιβεβαιώθηκε ότι στα εκχυλίσματα των μυκηλίων η συνολική συγκέντρωση των απλών πολυφαινολών είναι μεγαλύτερη από εκείνη των καρποσωμάτων και πως τα ΨΕ είναι αυτά με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση σε σχέση με τα ΘΕ. Ακόμα, συγκρίνοντας τη συνολική συγκέντρωση απλών πολυφαινολών των καρποσωμάτων σε Ο και Β όπως αυτή προέκυψε από τη μέθοδο SIM, δεν μπορούν να προκύψουν ασφαλή συμπεράσματα για το ποιο υπόστρωμα ευνοεί την παραγωγή μεγαλύτερης συγκέντρωσης απλών φαινολών, ενώ παρατηρείται διαφοροποίηση των ουσιών που ανιχνεύτηκαν στις πολυφαινόλες ανάλογα με το υπόστρωμα και το είδος της εκχύλισης. Επιπλέον, η διερεύνηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εκχυλισμάτων (0,5μl) έδειξε ότι τα ΨΕ είχαν μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση από τα αντίστοιχα εκχυλίσματα ΘΕ, λόγω μεγαλύτερης ικανότητας δέσμευσης της ελεύθερη ρίζα DPPH• (0,209 -0,563mM για τα ΨΕ και 0,179-0,302mM για τα ΘΕ) και παράτασης του χρόνου οξείδωσης του ορού (84,9-200,9 λεπτά για τα ΨΕ και 61-95 λεπτά για τα ΘΕ, όταν στα ~57 λεπτά αρχίζει η οξείδωση του ορού χωρίς την προσθήκη των εκχυλισμάτων). Αρκετά διαφορετική ήταν η εικόνα των εκχυλισμάτων των καρποσωμάτων, με τα περισσότερα να αδυνατούν να δεσμεύσουν την ελεύθερη ρίζα DPPH•, με εξαίρεση τα ΨΕ των G. adspersum, G. resinaseum και G. lucidum 332 που καλλιεργήθηκαν σε βελανιδιά. Τέλος, από τα πειράματα της μέτρησης της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας ορού διαπιστώθηκε ότι τα εκχυλίσματα καρποσωμάτων ΨΕ είχαν μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση από τα αντίστοιχα ΘΕ. Το συμπέρασμα αυτό προέκυψε όταν με την προσθήκη 0,5μl εκχυλίσματος παρατηρήθηκε παράταση του χρόνου οξείδωσης του ορού (55,1-63,9 λεπτά για τα ΨΕ και 46-54,7 λεπτά για τα ΘΕ, όταν στα ~39 λεπτά αρχίζει η οξείδωση του ορού χωρίς την προσθήκη των εκχυλισμάτων). Ίδια ήταν και η τάση που προέκυψε μετά την προσθήκη 1μl εκχυλίσματος, με μικρή παράταση του χρόνου οξείδωσης του ορού (60-84,8 λεπτά για τα ΨΕ και 54,7-67,8 λεπτά για τα ΘΕ, όταν στα ~39 λεπτά αρχίζει η οξείδωση του ορού χωρίς την προσθήκη των εκχυλισμάτων). Συνδυάζοντας όλα τα παραπάνω αποτελέσματα συμπεραίνεται ότι τα εκχυλίσματα του μυκηλίου χαμηλότερης θερμοκρασίας ήταν αυτά με τη μεγαλύτερη βιοδραστικότητα και η βελανιδιά το καλύτερο υπόστρωμα καλλιέργειας των μανιταριών Ganoderma. Λέξεις κλειδιά: μύκητες, Ganoderma, βελανιδιά, οξιά, βιομάζα, εξω-/ενδο-πολυσακχαρίτες, λιπίδια, εκχυλίσματα, απλές φαινόλες, τερπενοειδή, αντιοξειδωτική δράση, δοκιμασία DPPH, οξείδωση ορού

The aim of the present thesis was the study of bioactive potential of mycelium and basidiocarp water extracts of four Ganoderma species, G. adspersum, G. resinaceum, G. applanatum and G. lucidum, after liquid and solid fermentation. At first, the above mushrooms were cultured in submerged fermentation in order to obtain mycelium on glucose growth medium which was used as carbon source. The comparative evaluation between the species was based on their ability to utilize the substrate via the consumption of glucose and the production of mycelial mass, exo/ endopolysaccharite and lipids. The fermentation time completion was significantly smaller for G. applanatum, G. resinaseum and G. adspersum (~13 days) than G. lucidum (27 days), although in the last species the glucose consumption was total. All fungi produced sufficient amount of biomass (from 18,8 g/l in G. applanatum to 12 g/l in G. resinaseum and G. adspersum). Also, the quantity of exopolysaccharides was estimated as satisfactory (~0.5 g/l) and the amount of lipids was within the expected ranges (3-7% w/w). Particularly high were the values of endopolysaccharides in G. applanatum, G. resinaseum and G. adspersum mycelium (65-80% w/w in dry weight). In addition, after analysing the composition of endopolysaccharides and lipids, glucose was found the main simple sugar of endopolysaccharides, while D9,12C18:2 (linoleic acid) was found the fatty acid in the greatest amount. Next, solid state fermentation took place. The comparative evaluation between the species was based on their ability to utilize the lignocellulosic substrates beech and oak. Of the four species, only G. adspersum and G. resinaceum gave mature carposomes, 128 days after inoculation, in both substrates. Considering the % Efficiency (% E) (g fresh mushroom weight/ g fresh substrate weight) and the % Biological Efficiency (% B.E.) (g fresh mushroom weight/g dry substrate weight), the oak was the best culture medium, which positively affected the quantitative (number of fruiting, E%, BE%) and quality (humidity, average yielder weight) characteristics of the culture, with maximum values 6.32% BE and 1.23 g average mushroom weight in G. resinaceum. In addition, in all strains and substrates the polysaccharide content was ~40% w/w and that of lipids was 1-1.5% w/w. After having received the mycelial mass and the basidiocarps, their extraction at low (25 °C - CE) and high (100 °C - HE) temperature followed. In the last phase, the bioactivity of all extracts was investigated by determining their content in simple phenols, terpenoids, and their antioxidant activity. In tested basidiocarps was added G. lucidum strain 332, whose extract was prepared as in previous experiments. The determination of total phenolic content of the extracts was performed using the Folin-Ciocalteu method and the quantification of total terpenoids was done photometrically. The evaluation of antioxidant activity of the extracts was carried out by scavenging of 1,1-diphenyl-2-picryl-ydrazylo (DPPH •) free radical and measuring total serum oxidizability (TSO). Results showed that mycelium CE were richer in phenols (415-515 mg/l) and terpenoids (20.5-32.7 mg/g) than those of HE, whereas the content of phenols ranged from 155 to 187 mg/l and terpenoids from 7.9 to 15.3 mg/g. From all tested mycelium extracts, in G. resinaceum CE was found the largest content in simple phenols and terpenoids. Regarding the composition of phenols in mycelium extracts, p-OH-benzoic acid, caffeic acid and resveratrol were the common polyphenols. Similar was the trend in basidiocarp extracts although their phenol (153-223 mg/l in CE and 110-149 mg/l in HE) and terpenoid content (7.2- 12.1 mg/g in CE and 5.3-7.3 mg/g in HE) was lower than these of mycelium. Still, comparing the content of the extracts in phenolic and terpenoids per species and culture medium, mushrooms cultivated on oak contained more phenols and terpenoids than those on beech substrate. Regarding the composition of phenols in basidiocarp extracts, based on SIM method, vanilin, cinnamic acid, tyrosol, the p-OH-benzoic acid, vannilic acid, protocatechuic acid, syringic acid were the common polyphenols and less the caffeic acid and resveratrol.Considering the previous method, it was confirmed that in mycelium extracts, the total concentration of simple polyphenols were higher than this of basidiocarp extracts. Additionally, CE had the highest concentration of simple phenols compared to HE. However, comparing the total concentration of simple phenols in basidiocarp extracts in B and O, as it was shown by SIM method, it is difficult to draw reliable conclusions on which substrate favours the production of simple polyphenols, as depending on the substrate and the type of extraction, it was observed differentions on the detected substances. 6 Furthermore, the antioxidant activity of 0,5ml extracts showed that CE had more antioxidant activity than HE, due to their greater capacity for scavenging of free radical DPPH• (0.209 -0.563mM for the CE and 0.179-0.302mM for the HE) and increased lag-time (84.9-200.9 min for the CE and 61-95 min for the HE when lag-time in control required ~57 min). Quite different was the profile of the basidiocarp extracts. Most of them found to be unable to scavenge free radical DPPH•, except for G. adspersum, G. resinaseum and G. lucidum 332 grown on oak. Finally, from the experiments of total serum oxidizability was found that basidiocarp CE had higher antioxidant activity than those of HE. This conclusion resulted when 0.5ml extract added and an increase in lag time was observed (from 55.1 to 63.9 min for the CE and 46-54.7 min for the HE when lag-time in control required ~39 min). Same was the trend when 1ml of extract was added and slightly higher increase in lag time was observed (60-84.8 min for the CE and 54.7-67.8 min for the HE when lag-time in control required ~39 min). From these results it can be concluded that the mycelium cold extracts were those with the highest bioactivity and that oak was the best substrate for the cultivation of Ganoderma species. Keywords: fungus, Ganoderma, oak, beech, biomass, exo-/endo-polysaccharides, lipids, extracts simple phenols, terpenes, antioxidant activity, DPPH test, total serum oxidizability