Αύξηση της ζύμης Rhodotorula glutinis σε χαμηλού κόστους υδρόφιλα υποστρώματα προς παραγωγή λιπιδίων και δευτερογενών μεταβολιτών

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της ικανότητας αύξησης του ζυμομύκητα Rhodotorula glutinis NRRL YB-252 χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα ανανεώσιμες πρώτες ύλες, συγκεκριμένα ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη, η οποία είναι το κύριο παραπροϊόν της βιομηχανικής παραγωγής βιοκαυσίμου (biodiesel) και δευτερευόντως διάφορα σακχαρούχα προϊόντα (γλυκόζη, φρουκτόζη, ξυλόζη). Ειδικότερα, μελετήθηκε η ικανότητα του ζυμομύκητα να μεταβολίζει την ακάθαρτη βιομηχανική γλυκερόλη, την εμπορική γλυκόζη, την εμπορική φρουκτόζη και την εμπορική ξυλόζη προς παραγωγή βιομάζας, δευτερογενών μεταβολιτών (μικροβιακού λίπους και ενδοπολυσακχαριτών) και διαφόρων μεταβολικών προϊόντων (π.χ. αραβιτόλη, μαννιτόλη). Οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε σταθερές αρχικές συγκεντρώσεις υποστρώματος, σε σταθερές συνθήκες ανάδευσης και θερμοκρασίας. Όλες οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργειες κλειστού τύπου και σε κάθε περίπτωση ο λόγος C/N ήταν υψηλός (115 mol/mol), προκειμένου να ευνοηθεί η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Επιπλέον, μετά την αριστοποίηση των παραμέτρων της καλλιέργειας, έγινε εφαρμογή της διεργασίας σε βιοαντιδραστήρα και για το σκοπό αυτό επιλέχθηκε η ζύμωση που έδωσε τα πιο ικανοποιητικά αποτελέσματα, ήτοι 90 g/L γλυκερόλη. Κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας, ο ζυμομύκητας παρουσίασε σημαντική κυτταρική αύξηση σε όλα τα υποστρώματα (εκτός από τη ξυλόζη), καθώς και ικανοποιητική παραγωγή μικροβιακού λίπους. Συγκεκριμένα, στο μέσο με 90 g/L γλυκερόλη, ο ζυμομύκητας παρήγαγε 26.6 g/L βιομάζας και 7.1 g/L ενδοκυτταρικού λίπους με ποσοστό λιποσυσσώρευσης 34%. Αντίθετα, στη γλυκόζη (90 g/L), ο ζυμομύκητας εμφάνισε μικρότερη κυτταρική αύξηση (17.8 g/L) σε σχέση με τη γλυκερόλη και παρήγαγε 4.7 g/L λίπος με ποσοστό λιποσυσσώρευσης 26% καθώς και μικρή ποσότητα αραβιτόλης (4 g/L). Την ίδια συμπεριφορά παρουσίασε ο ζυμομύκητας και στο μέσο με φρουκτόζη (90 g/L) ως μοναδική πηγή άνθρακα, καθώς εμφάνισε παρόμοια κυτταρική αύξηση (18.2 g/L) σε σχέση με την γλυκόζη αλλά παρήγαγε λιγότερο λίπος (2.0 g/L) με ποσοστό λιποσυσσώρευσης 13%, που οφείλεται στην μεγάλη παραγωγή πολυολών [αραβιτόλη (4.6 g/L), μαννιτόλη (9.8 g/L)]. Αντίθετα με τα παραπάνω υποστρώματα, ο ζυμομύκητας δεν μπόρεσε να μεταβολίσει πλήρως την ξυλόζη, καταναλώνοντας μόνο την μίση αρχική ποσότητα του μέσου (90 g/L) και εμφανίζοντας μικρή κυτταρική αύξηση (9.5 g/L) και παραγωγή λίπους (1.3 g/L). Ωστόσο, στα μίγματα γλυκόζης-γλυκερόλης, ο μύκητας αναπτύχθηκε ικανοποιητικά και παρήγαγε παρόμοιες ποσότητες ενδοκυτταρικού λίπους. Στο μίγμα γλυκόζης-γλυκερόλης 45:45 (g/L), ο ζυμομύκητας παρήγαγε 20.4 g/L βιομάζα, 4.6 g/L ενδοκυτταρικό λίπος με ποσοστό λιποσυσσώρευσης 23%. Παρόμοια αποτελέσματα σημειώθηκαν κατά την καλλιέργεια του ζυμομύκητα στο μίγμα γλυκόζης-γλυκερόλης 67.5:22.5 (g/L), με παραγωγή βιομάζας 20.4 g/L, ενδοκυτταρικό λίπος 4.4 g/L και ποσοστό λιποσυσσώρευσης 22%. Επιπλέον, στο μίγμα γλυκόζης-γλυκερόλης 22.5:67.5 (g/L), ο ζυμομύκητας παρήγαγε 21.4 g/L βιομάζα και 4.1 g/L ενδοκυτταρικό λίπος με ποσοστό λιποσυσσώρευσης 19%. Η ζύμωση στο βιοαντιδραστήρα με 90 g/L γλυκερόλη έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα με παραγωγή βιομάζας 29.3 g/L και παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους 9.0 g/L με ποσοστό λιποσυσσώρευσης 36%. Η εξέλιξη της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα καταγράφηκε σε όλα τα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης και σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις (εκτός ξυλόζης) παρατηρήθηκε πλήρης εξάντλησή της. Αξίζει να σημειωθεί, ότι στα θρεπτικά υποστρώματα που περιείχαν τη γλυκόζη, είτε ως μοναδική πηγή άνθρακα είτε ως μίγμα, παρατηρήθηκε μικρή παραγωγή αραβιτόλης, η συγκέντρωση της οποίας φτάνει σε μια μέγιστη τιμή και στη συνέχεια φαίνεται να ανακαταναλώνεται κατά την εξέλιξη των ζυμώσεων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης του ενδοκυτταρικού λίπους σε λιπαρά οξέα και των κλάσεων αυτών σε επιλεγμένο δείγμα (ουδέτερα λιπίδια, σφιγγο-και γλυκολιπίδια και φωσφολιπίδια). Από την ανάλυση του ενδοκυτταρικού λίπους των παραπάνω δειγμάτων προκύπτει ότι το μεγαλύτερο ποσοστό του λίπους (70-80%) αποτελούνταν από ελαϊκό και παλμιτικό οξύ. Ενώ, κατά την κλασμάτωση των λιπιδίων παρατηρήθηκε ότι τα ουδέτερα λιπίδια (ΝL) αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό των ολικών λιπιδίων (TL) και ακολουθούν τα σφιγγο-και γλυκολιπίδια (S+G) και τα φωσφολιπίδια (Ρ) με χαμηλότερα ποσοστά. Μάλιστα, το κλάσμα των ουδέτερων λιπιδίων ομοιάζει σε σύσταση με αυτό των ολικών λιπιδίων (TL).

Aim of the present study was to investigate the biochemical behavior and ability of a yeast strain, namely Rhodotorula glutinis NRRL YB-252, to produce biomass and metabolic compounds such as single cell oil (SCO), during growth on media containing several types of hydrophilic low-cost carbon sources. The aforementioned microorganism was cultivated mainly on raw glycerol and secondary on sugar-based renewable carbon sources, such us glucose, fructose and xylose. Experiments were conducted in shake-flasks as well as in a bioreactor, while in any case, nitrogen limited media were employed in order to direct the microbial metabolism towards the synthesis of intra-cellular lipid (initial molar C/N ratio 115 moles/moles). The microorganism grew well in all substrates, (except of xylose) while lipid accumulation was overall satisfactory. Specifically, in the case of raw glycerol initial (90 g/L), Rh. glutinis produced 26.6 g/L biomass and 7.1 g/L lipid with lipid in dry cell weight (YL/X) = 34%. On the contrary, commercial glucose (90 g/L) resulted in lower final concentrations as far as DCW (17.8 g/L) and lipid accumulation (4.7 g/L) were concerned. Additionally, similar results were gained from the cultivation of the microorganism in media containing fructose (90 g/L) as sole carbon source. Rh. glutinis produced 18.2 g/L biomass accumulating 2.0 g/L lipid because of the high production of polyols (arabitol (4.6 g) and mannitol (9.8 g/L)). However, Rh. glutinis could not consume satisfactory the media that contained as sole carbon source commercial xylose (90 g/L), producing low values of biomass (9.5 g/L) and lipids (1.3 g/L). Moreover, the microorganism grew satisfactorily and produced noticeable amounts of lipids, in all glucose-glycerol mixtures. Especially, Rh. glutinis grew well on glucose-glycerol mixture 45:45 (g/L) and produced 20.4 g/L biomass with a lipid content of 4.6 g/L. Similar results arose from the cultivation of the microorganism on the glucose-glycerol mixture 22.5:67.5 (g/L), where the produced biomass was 21.4 g/L, containing 4.1 g/L lipid. Likewise, similar results derived from the cultivation of the microorganism on the glucose-glycerol mixture 67.5:22.5 (g/L), producing fair amounts of biomass (20.4 g/L) with lipid content (4.4 g/L). Finally, cultivation in bioreactor (raw glycerol initial ≈ (90 g/L)) gave satisfactory results concerning the produced biomass (29.3 g/L) and the accumulated lipid (9.0 g/L).Moreover, in substrates containing glucose, either as sole carbon source or as a mixture, production of arabitol took place. Analysis of intra-cellular lipid showed, that the major cellular FAs (70-80%) were oleate and palmitate. Furthermore, fraction analysis of total lipids revealed that mycelia contained higher amounts of neutral lipids (NL) than polar lipids (S+G, P). Finally, the composition of fatty acids of the neutral fraction resembled with that of total lipids.