Παραγωγή και μελέτη βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών μέσω βακτηριακών ζυμώσεων

Abstract

Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η ικανότητα παραγωγής πολυ-υδροξυαλκανοϊκών οξέων (PHAs) από βακτήρια του γένους Pseudomonas sp.. Αρχικά έγινε μια πρώτη επιλογή (screening) ανάμεσα σε 36 στελέχη βακτηρίων που ελήφθησαν από το εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων με ζύμωση σε στερεό θρεπτικό μέσο με χρήση της χρωστικής ουσίας Nile Blue. Εν συνεχεία με τη χρήση της ίδιας μεθόδου έγινε μια δεύτερη επιλογή σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα σε συνθήκες έλλειψης αζώτου. Τα 19 στελέχη επιλέχθηκαν βάση της ικανότητας φθορισμού στο υπεριώδες φως εμφανίζοντας έντονο μπλε χρώμα και μελετήθηκαν εν συνεχεία σε υγρές καλλιέργειες. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν και τέσσερα εμπορικά στελέχη με σκοπό να μελετηθεί η ικανότητα τους για την παραγωγή mcl-PHAs. Από τα στελέχη αυτά 3 ανήκαν στη συλλογή DSMZ, Pseudomonas chlororaphis DSM50083, Pseudomonas resinovorans DSM 21078, Pseudomonas citronellolis DSM 50332 και ένα στην συλλογή της ATCC, Pseudomonas putida (Trevisan) Migula ATCC 47054 (KT2440). Τα ανωτέρω στελέχη αναπτύχθηκαν σε υγρές καλλιέργειες σε συνθετικό θρεπτικό μέσο ενισχυμένο με άλατα και ιχνοστοιχεία. Ως πηγή άνθρακος χρησιμοποιήθηκε ακάθαρτη γλυκερόλη και απόβλητο έλαιο μαγειρικής. Από τα ανωτέρω στελέχη μόνο 6 παρήγαγαν πολυ-υδρόξυαλκανοϊκούς εστέρες σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Τα στελέχη αυτά είναι κατατεθειμένα στο είδος P. fluorescens, Ρ. gessardii, Ρ. chlororaphis και Ρ. fragi. Αναφορικά με τα εμπορικά στελέχη παρήγαγαν mcl-PHAs αλλά σε μικρές συγκεντρώσεις. Τα στελέχη που παρήγαγαν mcl-PHAs μαζί με τα εμπορικά στελέχη μελετήθηκαν περαιτέρω σε υπόστρωμα απόβλητο έλαιο μαγειρικής ως πηγή άνθρακος και υδρόλυμα ηλιαλεύρου ως πηγή αζώτου. Από τη ζύμωση αυτή μόνο το στέλεχος P. resinovorans (DSM 21078) παρήγαγε PHAs σε ικανοποιητική ποσότητα (0.63 g L-1) συγκριτικά με τους υπόλοιπους μικροοργανισμούς. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε να αναπτυχθεί σε βιοαντιδραστήρα σε συνθήκες ημιδιαλείποντος έργου (fed batch) με υπόστρωμα απόβλητο έλαιο μαγειρικής και υδρόλυμα ηλιαλεύρου. Στη ζύμωση αυτή η μέγιστη συγκέντρωση βιομάζας ήταν 14.8 g L-1 και η μέγιστη συγκέντρωση PHAs ήταν 0.88 g L-1. Τα μονομερή που παρήχθησαν ήταν 3-υδροξυ- 6 εξανοϊκό (C6), 3-υδροξυ-οκτανοϊκό (C8), 3-υδροξυ-δεκανοϊκό (C10) και 3-υδροξυ-δωδεκανοϊκό (C12). Τέλος πραγματοποιήθηκε μια μικρή μελέτη για την ικανότητα παραγωγής βιο-επιφανειοδραστικών ουσιών από τα ανωτέρω βακτήρια.

The aim of the present study was to investigate the ability of certain bacterial strains to produce poly-hydroxyalkanoates (PHAs). Initially, a screening experiment was performed in petri dishes using 36 bacterial strains, kindly provided from the Laboratory of Food Microbiology and Biotechnology, using the Nile blue staining technique. Subsequently, a second screening was carried out using the same method employing a nitrogen limited medium. The 19 strains showed fluorescence under UV light were selected for further study. In parallel, four strains belonging in culture collections namely Pseudomonas chlororaphis DSM 50083, Pseudomonas resinovorans DSM 21078, Pseudomonas citronellolis DSM 50332, Pseudomonas putida (Trevisan) Migula ATCC 47054 (KT2440), were also evaluated for their ability to synthesize PHAs. These strains were cultivated in submerged fermentations using synthetic medium supplemented with salts and minerals. Crude glycerol and waste cooking oil were evaluated as carbon sources. Only six of these strains successfully produced PHAs although at low concentrations. These strains were deposited as P.fluorescens, P. gessardii, P. chlororaphis and P. fragi. Low concentrations of mcl-PHAs were also attained by the the commercial strains. Subsequent experiments focused on the evaluation of waste cooking oil and sunflower meal hydrolysate as fermentation supplements for the production of mcl-PHAs using the selected strains. During these fermentation experiments, only the strain P.resinovorans (DSM 21078) was able to accumulate mcl-PHAs in sufficient concentration (0.63 g/L) compared to the other strains. Correspondingly, P. resinovorans was further evaluated in bioreactor cultivations performed under fed-batch conditions implementing waste cooking oil and sunflower hydrolysate as a nutrient rich feedstocks. Maximum dry weight concentration achieved was 14.8 g/L corresponding to a maximum mcl-PHA concentration of 0.88 g/L. The predominant monomers produced were 3-hydroxy-hexanoic (C6), 3-hydroxy-octanoate (C8), 3-hydroxy-decanoic (C10) and 3-hydroxy-dodecanoate (C12). Finally a preliminary study on the ability of all the above strains to produce biosurfactants was conducted using well established methods and techniques.