Βιοσύνθεση ενδοκυτταρικού λίπους υψηλού διατροφικού και φαρμακευτικού ενδιαφέροντος κατά την αύξηση του μύκητα Thamnidium elegans σε σακχαρούχα ανανεώσιμα υποστρώματα

Abstract

Η παρούσα ερευνητική μελέτη έχει στόχο τη διερεύνηση της βιοφυσιολογικής συμπεριφοράς του Ζυγομύκητα Thamnidium elegans (τάξη Μucorales) και της ικανότητας του να συσσωρεύει ενδοκυτταρικό λίπος πλούσιο σε γ-λινολενικό οξυ (GLA), ένα λιπαρό οξύ με σημαντικές διατροφικές και θεραπευτικές ιδιότητες. Η καλλιέργεια του μύκητα πραγματοποιήθηκε σε σακχαρούχα ανανεώσιμα υποστρώματα, τα οποία αποτελούν προϊόντα υδρόλυσης των λιγνοκυτταρινούχων υπολειμμάτων. Συγκεκριμένα, τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν η γλυκόζη και η ξυλόζη, καθώς και μίγματα αυτών. Όλες οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν σε καλλιέργειες κλειστού τύπου και σε κάθε περίπτωση ο λόγος C/N ήταν υψηλός (140 mol/mol), προκειμένου να ευνοηθεί η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους. Επιπλέον, μετά την αριστοποίηση των παραμέτρων της καλλιέργειας, έγινε εφαρμογή της διεργασίας σε βιοαντιδραστήρα και για το σκοπό αυτό επιλέχθηκε η ζύμωση που έδωσε τα πιο ικανοποιητικά αποτελέσματα, ήτοι 100 g/L γλυκόζη. Κατά τη διεξαγωγή της πειραματικής διαδικασίας, ο μύκητας παρουσίασε σημαντική κυτταρική αύξηση σε όλα τα υποστρώματα, καθώς και ικανοποιητική παραγωγή μικροβιακού λίπους πλούσιο σε GLA. Συγκεκριμένα, στο μέσο με 100 g/L γλυκόζη, ο μύκητας παρήγαγε 31.9 g/L βιομάζας και 15.0 g/L ενδοκυτταρικού λίπους με περιεκτικότητα σε GLA που έφτασε τα 1014.6 mg/L. Αντίθετα, στη ξυλόζη (100 g/L), ο μύκητας εμφάνισε μικρότερη κυτταρική αύξηση (21.4 g/L) σε σχέση με τη γλυκόζη και παρήγαγε 8.9 g/L λίπος με 534.4 mg/L GLA. Ωστόσο, στα μίγματα γλυκόζης-ξυλόζης, ο μύκητας αναπτύχθηκε ικανοποιητικά και παρήγαγε σημαντικές ποσότητες ενδοκυτταρικού λίπους με σημαντική περιεκτικότητα σε GLA. Στο μίγμα γλυκόζης-ξυλόζης 50:50 (g/L), ο μύκητας παρήγαγε 27.4 g/L βιομάζας, 12.6 g/L ενδοκυτταρικού λίπους και 974.9 mg/L GLA. Παρόμοια αποτελέσματα σημειώθηκαν κατά την καλλιέργεια του μύκητα στο μίγμα γλυκόζης-ξυλόζης 75:25 (g/L), με παραγωγή βιομάζας 29.5 g/L, ενδοκυτταρικό λίπος 10.8 g/L και 888.1 mg/L GLA. Επιπλέον, στο μίγμα γλυκόζης-ξυλόζης 25:75 (g/L), ο μύκητας παρήγαγε 27.1 g/L βιομάζας και 11.0 g/L ενδοκυτταρικού λίπους με 925.5 g/L GLA. Η ζύμωση στο βιοαντιδραστήρα με 100 g/L γλυκόζη έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα με παραγωγή βιομάζας 30.1 g/L και παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους 10.6 g/L. Ωστόσο, η περιεκτικότητα του λίπους σε GLA ήταν ελαφρώς χαμηλότερη και έφτασε τα 742.0 mg/L. Η εξέλιξη της κατανάλωσης της πηγής άνθρακα καταγράφηκε σε όλα τα θρεπτικά μέσα ανάπτυξης και σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε πλήρης εξάντλησή της. Αξίζει να σημειωθεί, ότι στα θρεπτικά υποστρώματα που περιείχαν τη ξυλόζη, είτε ως μοναδική πηγή άνθρακα είτε ως μίγμα, παρατηρήθηκε παραγωγή ξυλιτόλης, η συγκέντρωση της οποίας φτάνει σε μια μέγιστη τιμή και στη συνέχεια φαίνεται να ανακαταναλώνεται κατά την εξέλιξη των ζυμώσεων. Η μέγιστη ποσότητα ξυλιτόλης που παρήχθη ήταν 31.3 g/L όταν η ξυλόζη αποτέλεσε τη μοναδική πηγή άνθρακα. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης του ενδοκυτταρικού λίπους σε λιπαρά οξέα και των κλάσεων αυτών (ουδέτερα λιπίδια, σφιγγο-και γλυκολιπίδια και φωσφολιπίδια). Από τις αναλύσεις αυτές στην πλειοψηφία των δειγμάτων προκύπτει ότι τα μεγαλύτερα ποσοστά παραγωγής γ-λινολενικού οξέος (GLA) σημειώνονται κατά την πρώϊμη στάσιμη φάση του αυξητικού κύκλου, όταν δηλαδή η παραγωγή του ενδοκυτταρικού λίπους είναι χαμηλή. Επιπλέον, κατά την κλασμάτωση των λιπιδίων παρατηρήθηκε ότι τα ουδέτερα λιπίδια (Ν) αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό των ολικών λιπιδίων (TFA) και ακολουθούν τα σφιγγο-και γλυκολιπίδια (SG) και τα φωσφολιπίδια (Ρ) με χαμηλότερα ποσοστά. Μάλιστα, το κλάσμα των ουδέτερων λιπιδίων ομοιάζει σε σύσταση με αυτό των ολικών λιπιδίων, ενώ το κλάσμα των φωσφολιπίδιων, στις περισσότερες περιπτώσεις, εμφανίζει μεγαλύτερη ακορεστότητα σε σύγκριση με το ολικό λίπος του Ζυγομύκητα T. elegans.

Aim of the present study was to investigate the biochemical behavior and ability of a Zygomycetes strain, namely Thamnidium elegans, to accumulate single cell oil (SCO) rich in γ-linolenic acid (GLA), an unsaturated fatty acid (PUFA) of nutritional and medical importance. The aforementioned microorganism was cultivated on sugar-based renewable carbon sources, that are the principle products from hydrolysis of lignocellulosic residues. Particurarly, the substrates used were glucose and xylose, either as sole carbon source or as mixture in foregone proportions. Experiments were conducted in shake-flasks as well as in a bioreactor, while in any case, nitrogen limited media were employed in order to direct the microbial metabolism towards the synthesis of intra-cellular lipid (initial molar C/N ratio 140 moles/moles). The microorganism grew well in all substrates, while lipid accumulation was overall satisfactory. Specifically, in case of glucose (100 g/L) T. elegans produced 31.9 g/L biomass and 15.0 g/L lipid with significant high GLA content (1014.6 mg/L). On the contrary, xylose (100 g/L) represented lower final concentrations as far as growth (21.4 g/L) and lipid accumulation (8.9 g/L) were concerned. Howerer, the microorganism grew satisfactorily and produced noticeable amounts of lipids, rich in GLA, in all glucose-xylose mixtures. Especially, T. elegans grew well on glucose-xylose mixture 50:50 (g/L) and produced 27.4 g/L biomass with a lipid content of 12.6 g/L, yielding an amount of 974.9 mg/L GLA. Similar results arose from the cultivation of the microorganism on the glucose-xylose mixture 75:25 (g/L), where the produced biomass was 29.5 g/L, containing 10.8 g/L lipid and 888.1 mg/L GLA. Furthermore, the glucose-xylose mixture 25:75 (g/L) was proven an adequate substrate for T. elegans, by producing fair amounts of biomass (27.1 g/L) with satisfactory lipid content (11.0 g/L), while the GLA yield was 925.5mg/L. Finally, cultivation in bioreactor (glucose 100 g/L) gave satisfactory results concerning the produced biomass (30.1 g/L) and the accumulated lipid (10.6 g/L) but the GLA yield was lower (742.0 mg/L) compared with the corresponding shake-flask experiment. Moreover, in substrates containing xylose, either as sole carbon source or as a mixture, production of xylitol took place, reaching a highest value of 31.3 g/L in trials with xylose as sole carbon source. Analysis of intra-cellular lipid showed that the highest GLA content was observed in early stationary growth phase (ES). Furthermore, fraction analysis of total lipids revealed that mycelia contained higher amounts of neutral lipids (N) than polar lipids (SG, P). Additionally, the composition of fatty acids of the neutral fraction resembled with that of total lipids, while the phospholipids, in most cases, were the most unsaturated fraction compared to the other lipid fractions of T. elegans.