Μελέτη σχηματισμού βιοϋμενίου από το παθογόνο βακτήριο Cronobacter sakazakii σε μονοκαλλιέργεια ή συγκαλλιέργεια με το βακτήριο Bacillus subtilis

Abstract

Δύο γένη βακτηρίων, τα οποία εμφανίζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον για τη βιομηχανία τροφίμων και τη δημόσια υγεία, είναι τα Cronobacter και Bacillus. To Cronobacter sakazakii είναι ένα ευκαιριακό παθογόνο βακτήριο, η ανεύρεση του οποίου στη σκόνη βρεφικού γάλακτος έχει συσχετιστεί με πληθώρα περιστατικών τροφογενών λοιμώξεων σε νεογνά και βρέφη. Η σοβαρότητα των συμπτωμάτων υποδεικνύει την αναγκαιότητα πρόληψης επιμολύνσεων στο περιβάλλον παρασκευής και επεξεργασίας της φόρμουλας βρεφικού γάλακτος. Ταυτόχρονα, τα προϊόντα γάλακτος σε σκόνη επιμολύνονται συχνά με αλλοιωγόνα στελέχη του σποριογόνου βακτηρίου Bacillus subtilis, το οποίο είναι ιδιαίτερα διαδεδομένο στη φύση. Οι συχνότερες εστίες μικροβιακών επιμολύνσεων σε περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίμων είναι τα βιοϋμένια τα οποία έχουν σχηματιστεί σε επιφάνειες και εξοπλισμούς των βιομηχανιών. Η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου αποτελεί πλέον καθολικό γνώρισμα των βακτηρίων, το οποίο παρουσιάζει εξαιρετική ποικιλομορφία μεταξύ των ειδών και υπό διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Ειδικότερα, τα μικτά βιοϋμένια αποτελούν δυναμικά συστήματα, όπου κυριαρχούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφορετικών ειδών, έχοντας ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της προσαρμοστικότητας σε αντίξοες συνθήκες. Η ικανότητα προσκόλλησης και ανάπτυξης βιοϋμενίου των C. sakazakii και B. subtilis χωριστά έχουν μελετηθεί εκτενώς. Ωστόσο, λόγω της κοινής ανεύρεσής τους σε προϊόντα σκόνης γάλακτος, είναι πιθανό να συνυπάρχουν σε μορφή βιοϋμενίων. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής ήταν η αξιολόγηση της ικανότητας σχηματισμού βιοϋμενίου των βακτηρίων C. sakazakii και B. subtilis, υπό συνθήκες μονοκαλλιέργειας και συγκαλλιέργειας. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε αρχικά, ήταν η ανάπτυξη σε κουπόνια ανοξείδωτου χάλυβα, τα οποία εμβολιάστηκαν με τις βακτηριακές καλλιέργειες σε αλατούχο διάλυμα και επωάστηκαν στους 15oC για 3 h (στάδιο προσκόλλησης). Στη συνέχεια, τα κουπόνια με τα ισχυρώς προσκολλημένα βακτηριακά κύτταρα μεταφέρθηκαν σε θρεπτικό ζωμό και επωάστηκαν περεταίρω στους 37oC για 72 h ή στους 20oC για 144 h. Παράλληλα, έλαβαν χώρα συμπληρωματικές μετρήσεις ηλεκτρικής αγωγιμότητας με τη συσκευή Malthus, κατά την τελευταία δειγματοληψία. Σε δεύτερο στάδιο, πραγματοποιήθηκαν πειράματα, όπου ο θρεπτικός ζωμός αντικαταστάθηκε με γάλα, προκειμένου να ελεγχθεί η πιθανή επίδραση ενός τροφίμου, ως υπόστρωμα, στη βιοϋμενική ανάπτυξη του C. sakazakii στους 20οC. Οι ζώντες βιοϋμενικοί πληθυσμοί ανακτήθηκαν και προσδιορίστηκαν με δειγματοληψίες και μικροβιολογικές αναλύσεις ανά 24 h (37oC) ή 48 h (20oC). Στο δεύτερο μέρος των πειραμάτων, αξιολογήθηκε η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου σε μικροσυστοιχίες πολυστυρενίου (microtiter plates). Η βιοϋμενική ανάπτυξη ποσοτικοποιήθηκε μέσω χρωμομετρικής μεθόδου με κρυσταλλικό ιώδες, η οποία βασίζεται σε μετρήσεις οπτικής πυκνότητας της βιοϋμενικής μάζας που έχει σχηματιστεί στα τοιχώματα των βοθρίων των μικροσυστοιχιών. Όπως και στο πρώτο μέρος των πειραμάτων, ελέγχθηκε πρώτα η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου των C. sakazakii και B. subtilis σε συνθήκες μονοκαλλιέργειας και συγκαλλιέργειας σε θρεπτικό ζωμό (TSB και αραιωμένο TSB, dTSB 1:20). Οι μικροσυστοιχίες επωάστηκαν στους 5oC, 10oC, 20oC και 37oC. Ακολούθως, ο θρεπτικός ζωμός αντικαταστάθηκε με διαφορετικά είδη γάλακτος, ώστε να μελετηθεί η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου για τον C. sakazakii στις αντίστοιχες θερμοκρασίες. Ο σχηματισμός βιοϋμενίου βρέθηκε να επηρεάζεται από το χρόνο, το βακτηριακό είδος και τις συνθήκες καλλιέργειας (μονοκαλλιέργεια και μικτή καλλιέργεια). Όσον αφορά στα κουπόνια ανοξείδωτου χάλυβα, η μονοκαλλιέργεια του C. sakazakii φάνηκε να σχηματίζει σημαντικά (p<0,05) υψηλότερο βιοϋμένιο σε σύγκριση με τον B. subtilis, για τις πρώτες 48 h της επώασης στους 20oC. Στους 37oC, η ύπαρξη του B. subtilis στη συγκαλλιέργεια φάνηκε να ενισχύει σημαντικά (p<0,05) την ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου από τον C. sakazakii. Σε παρόμοια αποτελέσματα δεν κατέληξε η επώαση στους 20oC. Περνώντας στη δοκιμασία των μικροσυστοιχιών, δε λήφθηκαν εξίσου σημαντικά αποτελέσματα, καθώς οι τιμές τυπικής απόκλισης ήταν μεγάλες. Γενικότερα, τα πειράματα έδειξαν πως με την αύξηση της θερμοκρασίας οι τιμές οπτικής πυκνότητας αυξάνονται, γεγονός που μπορεί να ερμηνευτεί ως υψηλότερο επίπεδο σχηματισμού βιοϋμενίου. Ανάπτυξη βιοϋμενίου με γάλα ως θρεπτικό υπόστρωμα, υπήρξε μόνο στην περίπτωση της φόρμουλας βρεφικού γάλακτος, όταν οι μικροσυστοιχίες επωάστηκαν στους 20oC. Συμπερασματικά, η υψηλή ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου του παθογόνου βακτηρίου C. sakazakii, και στις δύο επιφάνειες που αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη, τονίζει τη σημασία της πρόληψης επιμόλυνσης και του σωστού και επαρκούς καθαρισμού των επιφανειών που δύναται να έλθουν σε επαφή με τρόφιμα. Επιπλέον, η σημαντική ενίσχυση της βιοϋμενικής ανάπτυξης του C. sakazakii σε κουπόνια ανοξείδωτου χάλυβα από την παρουσία του B. subtilis συνιστά ένα εξίσου σημαντικό εύρημα. Αν και μη παθογόνο, το βακτήριο B. subtilis αποτελεί σημαντικό πρόβλημα για τις γαλακτοβιομηχανίες, λόγω της αλλοίωσης των προϊόντων που προκαλεί. Βέβαια, εφόσον φάνηκε να ενισχύει την παραγωγή βιοϋμενίου ενός παθογόνου βακτηρίου, προστίθεται ένας ακόμη λόγος ανησυχίας, πέραν της αλλοίωσης των τροφίμων.

Two important bacterial genera for the food industry and public health are Cronobacter and Bacillus. Cronobacter sakazakii is an opportunistic foodborne pathogen commonly isolated from powdered infant formula. Consumption of contaminated infant formula has been correlated with numerous foodborne illness cases in neonates and infants. The severity of the symptoms underlines the need to prevent contamination of the production and processing environments. At the same time, milk powder products are also frequently contaminated with the spore-forming species of the genus Bacillus. One of the most common sources of microbial contamination of food is through biofilms formed on surfaces and equipment used in food industries. Nowadays, biofilm forming ability is alleged to be a universal trait of bacteria, showing many differences among species and under different environmental conditions. Multi-species biofilms especially, are dynamic systems, where variable interactions among the different species dominate, resulting in the reinforcement of adaptation under unfavorable environmental conditions. C. sakazakii and B. subtilis biofilm formation abilities under monoculture conditions has been extensively studied. However, due to their common isolation from powdered milk products, their coexistence within biofilm communities is likely. The aim of this study was to evaluate the biofilm-forming ability of C. sakazakii and B. subtilis under mono- or mixed-culture conditions. In the first place, biofilm formation was studied on stainless steel (SS) coupons utilizing a two-step procedure: SS coupons were initially incubated in saline bacterial suspensions at 15°C for 3 h (attachment step) and afterwards, coupons carrying strongly attached bacteria were further incubated in broth at 37°C for 72 h or at 20°C for 144 h. Meanwhile, supplementary electric impedance measurements took place, using the Malthus system device. Afterwards, broth was replaced with milk, in order to study food, instead of artificial medium, and its possible effect on biofilm growth of C. sakazakii at 20oC. Viable biofilm bacterial populations were determined, using the bead vortexing method, after initial attachment, and at 24-h and 48-h intervals during incubation at 37°C and 20°C, respectively. Then, biofilm formation was investigated and quantified via the crystal violet assay and optical density measurements. Likewise, the biofilm-forming ability of C. sakazakii and B. subtilis under mono- and mixed culture conditions was studied in broth (TSB and diluted TSB, dTSB 1:20 dilution) as artificial medium. The microtiter plates were incubated at 5oC, 10oC, 20oC and 37oC. Next, broth was substituted with different types of milk. Biofilm formation was found to be influenced by time, bacterial species and culture conditions (mono- or mixed-culture). Regarding the mono-culture conditions on SS coupons, C. sakazakii exhibited a significantly (p<0.05) higher biofilm formation compared to B. subtilis for the first 48 h of incubation at 20°C. Co-culture with B. subtilis within a dual-species community significantly (p<0.05) enhanced the biofilm-forming ability of C. sakazakii at 37°C; nonetheless, no corresponding difference was observed with regard to biofilm formation at 20°C. Microtiter plates results didn’t reach to such important results, as standard deviation values were high. In general, increase in temperature brought increase in optical density, which may be interpreted as higher level of biofilm growth. Biofilm formation in milk was only observed in infant formula incubated at 20oC. As a conclusion, the high biofilm-forming ability of the pathogenic C. sakazakii in both studied surfaces, underlines the need of prevention of contamination and adequate cleaning procedures of surfaces that can possibly come into contact with food. Moreover, the enhancement of C. sakazakii biofilm growth on SS coupons when co-cultured with B. subtilis, constitutes a really important finding. Even though B. subtilis is non-pathogenic, the spoilage that it can provoke causes problems to food industries. Hence, the enhancement of biofilm-formation of a pathogenic species caused by B. subtilis, raises additional concerns beyond its importance as food spoilage microorganism.