Συνδυασμός πρωτεϊνικών και πεπτιδικών δεδομένων με σκοπό την ταυτοποίηση νεφρικών πρωτεασών που εμπλέκονται στην επιδείνωση της χρόνιας νεφρικής ανεπάρκειας

Abstract

Η ανίχνευση στα αρχικά στάδια καθώς και η πρόβλεψη της εξέλιξης της νεφρικής νόσου παραμένει μια πρόκληση σύμφωνα με τις διαθέσιμες κλινικές μεθόδους. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, ερευνήθηκε το πρωτέομα και το πεπτίδομα σε δείγματα ούρων και πλάσματος αίματος με τη χρήση φασματομετρίας μάζας υψηλής ανάλυσης για την αναγνώριση βιολογικών δεικτών που σχετίζονται με τη χρόνια νεφρική νόσο (ΧΝΝ). Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στον συνδυασμό των δεδομένων που προέκυψαν από τις διαφορετικές ομικές προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση πρωτεολυτικών γεγονότων, συγκεκριμένων για τους νεφρούς. Αυτό περιλάμβανε τη πρόβλεψη πρωτεασών που εμπλέκονται στην επιδείνωση της ΧΝΝ, συμβάλλοντας με τον τρόπο αυτό στη διαλεύκανση των μηχανισμών που διέπουν την παθοφυσιολογία της νόσου. Τα ακόλουθα σύνολα δεδομένων που προέρχονται από δημοσιευμένες εργασίες καθώς και από εν εξελίξει εργασίες συνεργατών χρησιμοποιήθηκαν στην συνδυαστική ανάλυσή μας: i) πεπτίδια ύστερα από θρυψινοποίηση πρωτεϊνών στα ούρα και ii) φυσικά απαντόμενα πεπτίδια στα ούρα από μελέτες σχετικά με τη πρόγνωση της επιδείνωσης της ΧΝΝ, iii) πεπτίδια ύστερα από θρυψινοποίηση πρωτεϊνών στο πλάσμα από μια μελέτη σχετική με τη κατηγοριοποίηση της ΧΝΝ σε στάδια, iv) φυσικά απαντόμενα πεπτίδια στο πλάσμα που δε σχετίζονται με κάποια νόσο και v) πεπτίδια ύστερα από θρυψινοποίηση πρωτεϊνών από τη βάση δεδομένων Peptide Atlas. Η πρόβλεψη των πρωτεασών πραγματοποιήθηκε μέσω του λογισμικού Proteasix (proteasix.org). Κατά την ανάλυση, εκτιμήθηκαν η συχνότητα (δηλαδή το ποσοστό των δειγμάτων στα οποία ανιχνεύθηκε το πεπτίδιο) και η κάλυψη της πρωτεϊνικής ακολουθίας για κάθε ένα από τα πεπτίδια των 5 διαφορετικών σετ. Τα πεπτίδια θεωρήθηκαν νεφρο-ειδικά εάν ανιχνεύονταν μονάχα ως φυσικά απαντόμενα στα ούρα. Τα νεφρο-ειδικά (33 πεπτίδια) εξετάστηκαν περαιτέρω για τυχόν διαφορική έκφραση κατά την επιδείνωση της ΧΝΝ και για όσα βρέθηκαν ως διαφορικά εκφραζόμενα (13 πεπτίδια) πραγματοποιήθηκε πρόβλεψη για τις πρωτεάσες που είναι υπεύθυνες για την παραγωγή τους. Συνολικά προβλέφθηκαν 8 πρωτεάσες να στοχεύουν 6 διαφορετικά πεπτίδια και πραγματοποιήθηκε εκτίμηση της ρύθμιση ενεργότητας των πρωτεασών σύμφωνα με τη ρύθμιση των αντίστοιχων πεπτιδίων κατά την επιδείνωση της ΧΝΝ. Στη παρούσα μελέτη, παρουσιάσαμε ότι ο συνδυασμός πρωτεϊνικών και πεπτιδικών δεδομένων μπορεί να προβλέψει πεπτίδια που προέρχονται από τα νεφρά και να αυξήσει την εμπιστοσύνη στις προβλέψεις πρωτεασών, παρουσιάζοντας νέες ερευνητικές προοπτικές για μελλοντικά πειράματα. Αυτό, τελικά, πιθανά να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων μοριακών στόχων για θεραπευτικές παρεμβάσεις. Για την επιβεβαίωση της εγκυρότητας των ευρημάτων μας, στοχεύουμε στην ανίχνευση των πεπτιδίων σε δείγματα νεφρικού ιστού με τη χρήση στοχευμένης πρωτεομικής προσέγγισης.

Detection of early stages as well as prediction of kidney disease progression remains a challenge with the currently available clinical methods. To address this issue, we investigated the proteome and peptidome of urine and plasma samples using high resolution mass spectrometry, for the identification of biomarkers associated with the progression of Chronic Kidney Disease (CKD). We mainly focused on the integration of obtained -omics data for the identification of proteolytic events specific for the kidney. This includes prediction of proteases related to CKD progression, hence contributing to the elucidation of mechanisms underlying disease pathophysiology. The following datasets originating from published but also ongoing work from our collaborators, were used for data integration: i) urine tryptic peptides and ii) urine naturally occurring peptides from studies related to the prognosis of CKD progression; iii) plasma tryptic peptides from a study related to CKD staging; iv) plasma naturally occurring peptides not specific for any disease and v) tryptic peptides from the Peptide Atlas database. Protease prediction was performed using Proteasix software (proteasix.org). Peptide frequency (i.e. the percentage of samples in which the peptide was detected) and protein sequence coverage for each of the 5 datasets was assessed. Peptides were considered as kidney-specific if they have been detected only as naturally occurring in urine and not in plasma. The 33 kidney-specific peptides were further examined for putative differential expression in CKD progressors vs non-progressors, and those found as differentially expressed (13 peptides) were used for the prediction of proteases, responsible for their generation. In total, 8 proteases were predicted to target 6 kidney-specific and differentially expressed peptides. Furthermore, we attempted to assess the activity regulation trend of the predicted proteases in CKD progression, based on the regulation trend of the peptides that they target. In this study, we demonstrated that integration of proteomics and peptidomics data can predict peptides that originate from kidney and increase the confidence in protease predictions, opening new research avenues for future experiments. This ultimately, may lead to the discovery of novel molecular targets for therapeutic interventions. To confirm the validity of our findings, we currently aim at detecting shortlisted peptide candidates in kidney tissue using targeted proteomics approaches.