Διερεύνηση της οικοφυσιολογίας του σπόρου της Anthyllis barba-jovis L. και του in vitro πολλαπλασιασμού του είδους

Abstract

Η Anthyllis barba-jovis L. (Ανθυλλίς, Γενειάδα του Δία), είναι ένας πολυετής, αειθαλής, θάμνος της οικογένειας Fabaceae που αυτοφύεται σε απόκρημνες βραχώδεις πλαγιές της κεντροδυτικής λεκάνης της Μεσογείου. Παρουσιάζει ενδιαφέρον για τη φαρμακοβιομηχανία λόγω των αντιοξειδωτικών, αντιφλεγμονωδών και αντιδιαβητικών ιδιοτήτων του, καθώς και των αιθέριων ελαίων που βρίσκονται στα άνθη και στους σπόρους του. Η μορφολογία και η υψηλή του ανθεκτικότητα στην αλατότητα των εδαφών και στις δυσμενείς καιρικές συνθήκες, το κάνουν επίσης ενδιαφέρον είδος για χρήση ως καλλωπιστικό σε παραθαλάσσιες περιοχές και αποκαταστάσεις προβληματικών περιοχών. Με στόχο τη διάδοση του είδους ως καλλωπιστικό σε αστικές και περιαστικές περιοχές, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε αρχικά ο προσδιορισμός των κατάλληλων συνθηκών για μέγιστη βλαστικότητα των σπόρων. Η συλλογή των σπόρων έγινε από αυτοφυή φυτά, και διατηρήθηκαν σε σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου για 0, 12 και 24 μήνες. Μετά την απομάκρυνση του περικαρπίου και το μηχανικό σκαριφισμό, έγινε απολύμανση των σπόρων και τοποθετήθηκαν για βλάστηση in vitro, σε τρυβλία Petri, με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα ½ MS, σε θερμοκρασίες 5, 10, 15, 20, 25, 30 ή 35 οC σε συνεχές σκότος και σε φωτοπερίοδο 16 h (37.5 μmol m-2 s-1), από φως που προερχόταν από λαμπτήρες φθορισμού. Οι σπόροι, όλων των ηλικιών, βλάστησαν σε όλες τις επεμβάσεις, ενώ η φωτοπερίοδος δεν είχε σημαντική επίδραση στη βλαστικότητα. Οι σπόροι στους 5 και 35 οC σημείωσαν το χαμηλότερο ποσοστό βλαστικότητας (με σκαριφισμό 20-58% και 10-20%, ενώ χωρίς σκαριφισμό 4-20% και 16-30%, αντίστοιχα). Στους 10 έως 30 οC το ποσοστό βλαστικότητας κυμάνθηκε από 56-98% σε σκαριφισμένους σπόρους και 20-65% σε μη σκαριφισμένους. Ο σκαριφισμός είχε ευνοϊκή επίδραση στη βλαστικότητα, για όλες τις ηλικίες. Σκαριφισμένοι σπόροι εμφάνισαν την υψηλότερη βλαστικότητα (83-98%) στους 15 και 20oC, ενώ οι μη σκαριφισμένοι βλάστησαν σε υψηλότερα ποσοστά στους 20 oC για σπόρους 0 και 12 μηνών (59-65%) και στους 20 και 25 oC για σπόρους 24 μηνών (28-38%). Η διερεύνηση της βλαστικότητας των σπόρων έγινε και σε ex vitro συνθήκες, σε εδαφικό υπόστρωμα 1 τύρφη:1 περλίτη (v/v), με ή χωρίς προμεταχείριση μηχανικού σκαριφισμού ή με το περικάρπιό τους, σε θάλαμο σταθερών συνθηκών, στους 20 oC. Οι σπόροι που αποθηκεύτηκαν για 12 ή 24 μήνες έδωσαν χαμηλότερα αποτελέσματα από τους σπόρους πρόσφατης συλλογής. Διερευνήθηκε ακόμη, ο in vitro πολλαπλασιασμός του είδους από σπορόφυτα και νεαρά φυτά και έγινε εκτενής διερεύνηση ως προς την αποτελεσματικότητα διαφόρων φυτορυθμιστικών ουσιών στη μεγιστοποίηση της βλαστογένεσης από έκφυτα ενός κόμβου. Ως βασικό υπόστρωμα όλων των in vitro καλλιεργειών χρησιμοποιήθηκε το MS. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση των BA και NAA, στη βλαστογένεση από έκφυτα κοτυληδικού κόμβου νεαρών σποροφύτων. Στο στάδιο της αρχικής εγκατάστασης όλα τα υποστρώματα σημείωσαν υψηλό ποσοστό βλαστογένεσης (81-91%), ενώ υψηλότερη παραγωγή βλαστών (1,9 βλαστοί/έκφυτο) παρατηρήθηκε στα υποστρώματα με 1,0 mg l-1 BA με ή χωρίς 0,1 mg l-1 NAA, χωρίς διαφορά από τα υποστρώματα με 0,5/0,1 mg l-1 BA/NAA. Ακολούθησε υποκαλλιέργεια σε υπόστρωμα MS με 0,5 ή 1,0 mg l-1 BA σε συνδυασμό με 0,1 mg l-1 NAA, καθώς και σε υπόστρωμα χωρίς φυτορυθμιστικές ουσίες. Σημειώθηκε υψηλό ποσοστό βλαστογένεσης (86-91%) σε όλα τα υποστρώματα. Μεγαλύτερος αριθμός βλαστών σημειώθηκε στο υπόστρωμα με 1,0/0,1 mg l-1 BA/NAA (8,1 βλαστοί/έκφυτο), ενώ το μήκος των βλαστών ήταν παρόμοιο σε όλα τα υποστρώματα (1,2-1,3 cm). Υψηλό ποσοστό υπερενυδάτωσης παρατηρήθηκε στα υποστρώματα που περιείχαν φυτορυθμιστικές ουσίες (55-65%), αλλά οι βλαστοί στο υπόστρωμα με 0,5/0,1 mg l-1 BA/NAA είχαν πιο ικανοποιητική εμφάνιση και ήταν καλοσχηματισμένοι. Mικροβλαστοί τοποθετήθηκαν για ριζοβολία σε υποστρώματα ½ MS ή ½ WPM ή ½ SH χωρίς IBA ή εμπλουτισμένα με 0,5 ή 2,0 mg l-1 IBA. Το ποσοστό ριζοβολίας ήταν υψηλό (80-100%) σε όλα τα υποστρώματα, ενώ εκείνα με 0,5 mg l-1 IBA έδωσαν αυξημένο μήκος ριζών (11,2-17,5 cm) σε σύγκριση με εκείνα που περιείχαν 2,0 mg l-1 ΙΒΑ (5,6-8,1 cm). Τα φυτάρια εγκλιματίστηκαν με 97% επιτυχία σε ex vitro συνθήκες. Ο in vitro πολλαπλασιασμός του είδους από νεαρά φυτά αφορούσε στη μελέτη της επίδρασης των BA, ZEAT, KIN, και 2iP, σε συγκεντρώσεις 0,0 ή 0,5 ή 1,0 ή 1,5 mg l-1, στη βλαστογένεση. Κατά την αρχική εγκατάσταση υψηλότερη παραγωγή βλαστών (3,5 βλαστοί/έκφυτο) παρατηρήθηκε στο υπόστρωμα με 1,0 mg l-1 BA, όπου σημειώθηκε και η μεγαλύτερη επιμήκυνση των παραχθέντων μικροβλαστών (0,9 cm). Ακολούθησε υποκαλλιέργεια με στόχο την παραγωγή περισσότερων βλαστών. Στη δεύτερη υποκαλλιέργεια σημειώθηκε υψηλό ποσοστό βλαστογένεσης σε όλα τα υποστρώματα (88-100%), ενώ υπό την παρουσία ΒΑ αυξήθηκε πολύ ο αριθμός των παραγόμενων βλαστών (4,2-11,0 βλαστοί/έκφυτο). Τα υποστρώματα με 2iP και ΚIN έδωσαν μεγαλύτερο μήκος βλαστών (2,1-3,6 cm και 1,2-2,0 cm, αντίστοιχα) απ’ ότι τα υποστρώματα που περιείχαν ΒΑ και ΖΕΑ (0,9-1,3 cm και 1,4-1,6 cm, αντίστοιχα). Υπό την παρουσία ΒΑ αυξήθηκε πολύ ο αριθμός των υπερενυδατωμένων βλαστών (4,7-5,8 υπερενυδ. βλαστοί/έκφυτο). Η ριζοβολία έγινε σε υποστρώματα MS ή ½ MS χωρίς ΙΒΑ, ή σε ½ MS εμπλουτισμένα με 1,0 ή 2,0 mg l-1 IBA. Το ποσοστό ριζοβολίας στο MS ήταν χαμηλότερο (60%) απ’ ότι στο ½ MS, με ή χωρίς την παρουσία IBA (98% και 84%, αντίστοιχα), ενώ τον μεγαλύτερο αριθμό ριζών σημείωσε το υπόστρωμα με 2,0 mg l-1 IBA (3,9 ρίζες/μικροβλαστό). Τα φυτάρια εγκλιματίστηκαν με 92% επιτυχία σε ex vitro συνθήκες.

Anthyllis barba-jovis L. ("Jupiter's Beard") is a native, silvery evergreen shrub of family Fabaceae, found in rocky cliffs of Mediterranean region. The species is used in the pharmaceutical industry due to its antioxidants, anti-inflammatory and anti-diabetic properties, as well as for the essential oils found in flowers and seeds. The morphology of the plant and its high tolerance to high salinity, wind and drought provides the potential to be introduced as an ornamental landscape plant for coastal Mediterranean areas. Purpose of this study was to enable its conservation and facilitate its use as an ornamental and landscape plant, as well as a plant suitable for landscape restorations and sustainable reclamation of special landscapes. For this purpose was investigated and determined the seed germination. Seeds were collected from selected wild plants and stored in darkness at room temperature for 0, 12 and 24 months. After the separation from the fruit flesh and the mechanical scarification methods, the seeds were placed on Petri dishes and germinated on half-strength MS medium, at 5, 10, 15, 20, 25, 30 or 35°C under 16 h photoperiod and 37.5 μmol m-2s-1 fluorescent light or continuous darkness. Seeds, stored 0, 12 or 24 months, germinated in all treatments, while the photoperiod had no significant effect on germination ability. Seeds showed very low levels of germination at 5 and 35°C (scarification 20-58% and 10-20%, without scarification 4-20% and 16-30%, respectively). At 10 and 30°C the germination was 56-98% with scarification method and 20-65% without scarification. The scarification method was more effective in all seeds. Scarified seeds showed high germination levels at 15 and 20oC (83-98%), while non-scarified seeds, stored 0 and 12 months, germinated better at 20 oC (59-65%) and at 20 and 25 oC for non-scarified seeds that stored 24 months (28-38%). The germination capacity of seeds was examined also in a soil substrate, consisting of a mix of 1 peat: 1 perlite (v/v), with or without scarification treatment or keeping the fruit flesh, at 20 oC. Seeds stored for 12 or 24 months showed lower germination levels than those who were not stored at all. Furthermore, was investigated the in vitro propagation of the species from young plants and young seedlings and also the effectiveness of various plant growth regulators on shoot proliferation from single-node explants. The main medium for all in vitro cultures was MS medium. Specifically, examined the effectiveness of BA and NAA on shoot proliferation from cotyledonary nodes excised from young seedlings. In culture establishment, all treatments produced shoots at high percentages (81-91%), while the presence of 1.0 mg l-1 BA, with or without 0.1 mg l-1 NAA induced the shoot proliferation (1.9 shoots per explant). A subculture took place on MS medium supplemented with BA (0.5 or 1.0 mg l-1) combined with 0.1 mg l-1 NAA or hormone-free. Shooting reached 86-91% in all treatments. Higher shoot production was promoted by 1.0/0.1 mg l-1 BA/NAA (8.1 shoots per explant), while shoot length was similar in all media (1.2-1.3 cm). Shoots reported above, bear hyperhydric shoots at high percentages (55-65%), while at media with 0.5/0.1 mg l-1 BA/NAA the shoots were more well formed. Microshoots rooted at ½ MS ή ½ WPM ή ½ SH media with 0.5 and 2.0 mg l-1 IBA or without IBA. Rooting percentage was high in all treatments (80-100%), while media supplemented with 0.5 mg l-1 IBA gave longer roots (11.2-17.5 cm), than those supplemented with 2.0 mg l-1 IBA (5.6-8.1 cm). Ex vitro acclimatization was highly successful (97%) on a mix of 1 peat: 1 perlite (v/v). The effectiveness of various cytokinin types as BA, ZEA, 2iP and ΚIN, (0.0 or 0.5 or 1.0 or 1.5 or 2.0 mg l-1) was also tested on shoot proliferation from single-node explants excised from young plants. In culture establishment, media supplemented with 1.0 mg l-1 BA, not only produced more shoots (3.5 shoots per explant), but also gave longer shoots (0.9 cm). A first subculture took place, with the aim of producing adequate number of microshoots for further experimentation. In the following subculture, explants in all treatments produced shoots at high percentage (88-100%), while the presence of BA formed many more shoots (4.2-11.0 shoots per explant). The use of 2iP and ΚIN formed longer shoots (2.1-3.6 cm and 1.2-2.0 cm, respectively), than ZEA and BA (0.9-1.3 cm and 1.4-1.6 cm, respectively). Shoots reported above, bear many hyperhydric shoots at media with BA (4.7-5.8 hyperhydric shoots per explant). Root induction examined also after the subcultures stages at media with MS or ½ MS medium supplemented with or without 1.0 or 2.0 mg l-1 IBA. Microshoots at MS media rooted in low percentages (60%), than at ½ MS media, supplemented with or without IBA (98% and 84%, respectively). Media with 2.0 mg l-1 IBA formed more roots (3.9 roots per microshoot). Ex vitro acclimatization of plantlets was very high, with well-formed plants (92%), on a mix of 1 peat: 1 perlite (v/v).