Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των ακατέργαστων υδατικών εκχυλισμάτων από
μικροφύκη Chlorella sp., Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. και Phaeodactylum sp.. Μια τέτοια
μελέτη στοχεύει στην ανάγκη εύρεσης νέων πράσινων πηγών, πλούσιων σε αντιοξειδωτικές
ουσίες, ώστε να χρησιμοποιηθούν ως πρώτες ύλες στη βιομηχανία τροφίμων και καλλυντικών.
Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν ένζυμα GSTs από το γένος Chlamydomonas με στόχο την απόκτηση
περαιτέρω γνώσεων που σχετίζονται με GSTs από θαλάσσιους οργανισμούς.
Αρχικά, πραγματοποιήθηκε σάρωση οκτώ διαφορετικών στελεχών από μικροφύκη Chlorella sp..
Συγκεκριμένα η μελέτη αφορούσε στην αξιολόγηση των ακατέργαστων εκχυλισμάτων ως προς
την αντιοξειδωτική ιδιότητα και στη μελέτη της ανασταλτικής ικανότητας ως προς ένζυμα με
ιδιαίτερο ενδιαφέρον και άμεση εφαρμογή στον τομέα της κοσμετολογίας. Τα αποτελέσματα της
συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας (μέσω των μη ενζυματικών μεθόδων Frap, ABTS και
DPPH) έδειξαν διαφορετικό προφίλ μεταξύ των στελεχών γεγονός που υποδηλώνει μια
σημαντική χημική πολυμορφία των αντιοξειδωτικών στα είδη Chlorella. Οι διαφοροποιήσεις
στην αντιοξειδωτική ικανότητα μεταξύ των στελεχών ίσως να σχετίζεται στη διαφορετική
ικανότητα προσαρμογής στις διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης. Υψηλότερη ανασταλτική ισχύ
έναντι των ενζύμων τυροσινάση και ελαστάση παρουσίασε το ακατέργαστο εκχύλισμα της
Chlorella minutissima, με τιμές IC50 23,3 ± 2.5 και 29,2 ± 2,7 μg αντίστοιχα. Επίσης, το
συγκεκριμένο στέλεχος μελετήθηκε υπό διαφορετικές συνθήκες φωτισμού (διαφορετικό μήκος
κύματος ακτινοβολίας) και υπό διαφορετική ένταση φωτός (υψηλή, μέτρια και χαμηλή). Τα
αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι τα είδη Chlorella εμφανίζουν πολλές ιδιότητες και
αποτελούν μια πλούσια πηγή σε αντιοξειδωτικές και αντι-γηραντικές ουσίες, γεγονός που καθιστά
τα συγκεκριμένα εκχυλίσματα αρκετά υποσχόμενα για χρήση ως πρώτη ύλη στη βιομηχανία
καλλυντικών.
Στη συνέχεια ακολουθεί η μελέτη σάρωσης τριών διαφορετικών ειδών μικροφυκών:
Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. και Phaeodactylum sp, τα οποία αναπτύχθηκαν σε
διαφορετικές συνθήκες καταπόνησης (σε συνθήκες φυσιολογικές, υψηλής θερμοκρασίας, υψηλής
αλατότητας 5‰ (w/v) και έλλειψης αζώτου). Τα ακατέργαστα εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν ως
προς επιλεγμένες ενζυμικές δραστικότητες (ένζυμα εξαρτώμενα της γλουταθειόνης, περοξειδάσες
και σουπεροξειδικές δισμουτάσες) με ιδιαίτερο ενδιαφέρον στο χώρο της βιομηχανίας. Τα
αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ακατέργαστα εκχυλίσματα των Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp.
και Phaeodactylum sp. εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία στα προσδιοριζόμενα ένζυμα. Η
iv
διαφοροποίηση που παρατηρήθηκε μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών καταπόνησης πιθανόν να
οφείλεται στη διαφορετική προσαρμοστικότητα του εκάστοτε είδους σε αυτές αλλά και στη
διαφορετική βιοχημική τους σύσταση.
Με στόχο την κατανόηση του ρόλου των GSTs στους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς αλλά και
την εύρεση στοιχείων για την ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών εφαρμογών, ακολούθησε η μελέτη
του γονιδιώματος Chlamidomonas reinhardtii. Τα αποτελέσματα φανέρωσαν την παρουσία 15
GST-like ενζύμων (CrGSTs) τα οποία αναλύθηκαν φυλογενετικά. Τα ισοένζυμα CrGST10 και
CrGST7, που φαίνεται να ανήκουν στη Sigma τάξη, κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν σε
βακτηριακά κύτταρα E. coli και προσδιορίστηκε η εκλεκτικότητά τους έναντι ηλεκτρονιόφιλων
υποστρωμάτων. Ακολούθησε μελέτη της δομής και της κινητικής συμπεριφοράς με μοριακή
μοντελοποίηση και κατευθυνόμενη μεταλλαξογέννεση. Συγκεκριμένα, επιβεβαιώθηκε ο
καταλυτικός ρόλος του αμινοξέος Tyr7 ενώ διερευνήθηκε ο ρόλος του αμινοξέος Trp99 στον
προσδιορισμό εξειδίκευσης ηηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων, στην επίδραση του pH και στη
θερμοσταθερότητα.
Η διατριβή ολοκληρώθηκε με την απομόνωση του ενζύμου CrGST8 από cDNA βιβλιοθήκη
Chlamidomonas, το οποίο φαίνεται να ανήκει στην τάξη Theta. Η υπερέκφραση του ενζύμου
CrGST8 οδήγησε σε ενδοκυτταρική συσσώρευση μερικώς αναδιπλωμένων πρωτεϊνών (έγκλειστα
σωμάτια). Ακολούθησαν δοκιμές βελτιστοποίησης των συνθηκών έκφρασης με χρήση
διαφορετικής συγκέντρωσης IPTG και θερμοκρασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι
συγκεκριμένοι παράγοντες δεν επηρεάζουν στη δημιουργία των συσσωματωμάτων. Στη συνέχεια
έγινε χρήση χαοτροπικών ουσιών όπως η ουρία και το χλωρίδιο του γουανιδίου. Με σκοπό τον
έλεγχο της επίδρασης μιας ηπιότερης μεθόδου αναδίπλωσης, έγινε δοκιμή διαλυτοποίησης του
ενζύμου με χρήση προπανόλης. Θετικά αποτελέσματα παρουσίασαν μόνο οι χαοτροπικές ουσίες
και κυρίως η ουρία. Έπειτα πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας του ενζύμου έναντι
διαφορετικών υποστρωμάτων. Το ένζυμο CrGST8 φαίνεται να εμφανίζει ιδιαίτερη προτίμηση, με
φθίνουσα σειρά, για τα υποστρώματα π-νιτροβενζυλ-χλωρίδιο (PNBC) και 2,2-διθειοδιαιθανόλη
(HED), 4-χλωρο-7-νιτροβενζο-2-οξο-1,3-διαζόλιο (NBD-Cl) και 1-χλωρο-2,4-δινιτροβενζόλιο
(CDNB). Η επίδραση του pH στην ενζυμική δραστικότητα του CrGST8 έδειξε ότι εμφανίζει
προτίμηση στην όξινη περιοχή των pH με μέγιστη τιμή στο pH 5,6, ενώ σε pH 7 η ενζυμική
δραστικότητα έχει σχεδόν μηδενιστεί.
Συνοψίζοντας, τα μικροφύκη έχουν κεντρίσει την προσοχή του βιομηχανικού τομέα, με την
εφαρμογή τους να απαντάται σε ποικιλία προϊόντων όπως σε τρόφιμα, φάρμακα και καλλυντικά.
Η χρήση αντιοξειδωτικών από φυσικές και πράσινες πηγές όπως τα μικροφύκη αντιπροσωπεύει
v
έναν τομέα που κερδίζει μεγάλο ενδιαφέρον στη διάρκεια του χρόνου με ευρύ φάσμα
βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν ότι τα εκχυλίσματα των ειδών
Chlorella και κυρίως του στελέχους Chlorella minutissima, αντιπροσωπεύουν πολλά υποσχόμενα
βιοδραστικά συστατικά με δυνατότητα χρήσης τους ως πρώτες ύλες. Επιπρόσθετα, τα
ακατέργαστα υδατικά εκχυλίσματα των Phaeodactylum sp., Tetraselmis sp. και Nannochloropsis
sp. παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές ως προς το αντιοξειδωτικό δυναμικό εκφράζοντας μεγάλη
χημική ποικιλομορφία αντιοξειδωτικών ουσιών, ενώ οι διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης
φαίνεται να επηρεάζουν την έκφραση ενζύμων και αντιοξειδωτικών ουσιών υψηλής
προστιθέμενης αξίας. Tέλος, ο χαρακτηρισμός των ενζύμων CrGST10, CrGST7 και CrGST8 από
το στέλεχος Chlamydomonas reinhardtii και η φυλογενετική ανάλυση έδωσαν πληροφορίες
σχετικά με την εξέλιξη της οικογένειας των GSTs και το μηχανισμό δέσμευσης του
υποστρώματος και εξειδίκευσης.
Microalgae are an extremely heterogeneous group of organisms. This genetic diversity makes
microalgae, a rich source of a vast array of biomolecules with applications in the feed, food,
nutritional, cosmetic, pharmaceutical and even fuel industries. The purpose of the present study
was the evaluation of selected Chlorella, Nannochloropsis, Tetraselmis and Phaeodactylum
strains as a source of high value added products.
In the first part of the work, aqueous extracts from eight Chlorella strains were evaluated towards
selected cosmeceutical properties such as enzymatic and non-enzymatic antioxidant capacity,
glutathione content and inhibition potency towards skin regulatory enzymes (tyrosinase and
elastase). The results showed that the Chlorella strains display wide catalytic diversity with
different strains exhibiting quite varied antioxidant enzymatic activities. Enzymatic antioxidant
capacity of glutathione reductase, peroxidase, and superoxide dismutase were found in all strains,
whereas only Chlorella minutissima crude extract displays glutathione transferase activity. Total
antioxidant capacity (TAC) measurements, determined by a series of non-enzymatic assays
(FRAP, ABTS, DPPH), showed significant variabilities among strains suggesting a large chemical
diversity of antioxidants in Chlorella species. Finally, Chlorella minutissima extract showed high
inhibitory activity with IC50 23.3 ± 2.5 and 29.2 ± 2.7 μg towards tyrosinase and elastase,
respectively. These results suggest a potential activity of Chlorella minutissima crude extract in
controlling skin aging, inflammatory process, and pigmentation.
The second part of the work provides the characterization of the chemical and enzymatic content
of three species Nannochloropsis, Phaeodactylum and Tetraselmis, grown under different
conditions (high temperature, 5 ‰ salinity and low levels of nitrogen). The results showed that the
different culture conditions affect the expression of antioxidant enzymes, proteases and lipases. In
addition, the levels of selected metabolites and antioxidant compounds are influences by the
grown conditions. Taken together, these results demonstrate that the engineering of culture
conditions of Nannochloropsis, Phaeodactylum and Tetraselmis may provide an efficient
approach for metabolic engineering and the production of high added value biomolecules.
Understanding the genetic and molecular basis of the detoxifying mechanism in Chlamydomonas
reinhardtii is an important goal towards the development of bioremediation tools for contaminated
environments. Glutathione transferases (GSTs, EC 2.5.1.18) are phase II metabolic enzymes that
play important role in the detoxification of xenobiotic compounds. GSTs have been characterized
vii
extensively in land plants and animals but no evidence has yet been reported for their presence in
C. reinhardtii. A genome survey of C. reinhardtii revealed the presence of fifteen GST-like
isoenzymes (CrGSTs). Comparison by multiple sequence alignment generated a dendrogram,
revealing the phylogenetic relationships of CrGSTs with other well-characterized GST classes.
Notably, we identified sequences that are most closely related to the sigma class enzymes which
so far have only been found in animals. Two sigma class related isoenzymes (CrGST10 and
CrGST7) were cloned, expressed in E. coli and their substrate specificity and kinetic properties
were determined towards a range of different xenobiotic substrates. The structural and kinetic
features of the enzymes were studied by molecular modelling and site-directed mutagenesis. The
catalytic role of active-site residue Tyr7 and the roles of Trp99 in determining substrate specificity
and thermostability were investigated. Analysis of GSTs in green algae provides an opportunity to
shine light on the roles of GSTs in cellular detoxification mechanism as well as to develop new
biotechnological and environmental applications.
In the next part, the functional and catalytic properties of the isoenzyme CrGST8 was
investigated. CrGST8 belong to the Theta class of GSTs and noticeable lacks the C-terminal helix.
CrGST8 was cloned and expressed in E. coli. SDS/PAGE analysis of crude lysates and cell debris
showed that the enzyme is overexpression in the form of inclusion bodies. The effect of
temperature and IPTG concentration on CrGST8 expression was evaluated. Different chaotropic
agents (urea and/or guanidium chloride) and buffer conditions were assessed towards
solubilisation and refolding of CrGST8. The results showed that high concentration of urea and
Tris buffer containing arginine and GSH provides the appropriate condition for solubilization and
refolding of the enzyme. The enzyme was characterized by kinetic analysis, pH evaluation and
heat inactivation. These results provide new information into GST diversity and give further
insights into the complex regulation and enzymatic functions of this gene super-family.
