Συγκριτική γενωμική των μικροσποριδίων της μέλισσας. Εφαρμογή που παρουσιάζει τα σύγχρονα δεδομένα της παρασίτωσης από Nosema των μελισσών στην Ελλάδα

Abstract

Η παρούσα εργασία αφορά την μελέτη, με μεθόδους μοριακής γενετικής, γενετικής μηχανικής και βιοπληροφορικής, των μικροσποριδίων Nosema apis και Nosema ceranae τα οποία ευθύνονται για την ασθένεια νοζέμωση που προσβάλλει τις μέλισσες. H μέλισσα θεωρείται το πιο σπουδαίο έντομο από οικονομικής άποψης παίζει δε επίσης ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του οικοσυστήματος, γεγονός που αποδεικνύει την αναγκαιότητα της προσπάθειας αντιμετώπισης της νοσέμωσης η οποία αποτελεί ολοένα και σοβαρότερο πρόβλημα στη μελισσοκομία. Η έως σήμερα φαρμακευτική προσέγγιση της νόσου μέσω του αντιβιοτικού φουματζιλλίνη δεν θεωρείται πλέον ικανοποιητική καθότι η φουματζιλλίνη χρησιμοποιείται κυρίως ενάντια στο μικροσπορίδιο Νosema apis το οποία ήταν εκείνο που παρασιτούσε στην δυτική μέλισσα Apis mellifera στην Ευρώπη και την Αμερική. Η από δεκαετίας όμως διαρκώς και συχνότερη εύρεση του μικροσποριδίου Nosema ceranae της ασιατικής μέλισσας Apis cerana και στην Apis mellifera αλλάζει τα φαρμακευτικά δεδομένα αφού διαπιστώνεται ότι η φουματζιλλίνη δεν εμφανίζεται εξίσου αποτελεσματική σε αυτό το είδος μικροσποριδίου. Καθίσταται λοιπόν πλέον επιτακτική η ανάγκη εύρεσης νέων μέσων για την αποτελεσματική αντιμετώπιση της νόσου. Στην παρούσα εργασία γίνεται η παρουσίαση μιας µεθοδολογικής προσέγγισης μέσω της οποίας μπορούν να επιλεγούν δυνητικά καινούργιοι φαρμακευτικοί στόχοι ενάντια στη νοσέμωση. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν δεκατέσσερα δείγματα μελισσών από ασθενείς κυψέλες με συμπτώματα νοσέμωσης που προέρχονται από διαφορετικά μέρη της Ελλάδας. Αρχικά τα δείγματα μικροσκοπήθηκαν για να διαπιστωθεί η παρασίτωσή τους από τα μικροσποριδία και ακολούθησε ο ποσοτικός προσδιορισμός των σπορίων που περιείχαν. Χρησιμοποιώντας μοριακές μεθόδους (αντιδράσεις PCR) χαρακτηρίστηκαν όλα τα δείγματα για την μόλυνση μόνο από N. ceranae, γεγονός που επιβεβαιώνει την διαπίστωση πως η τελευταία αντικαθιστά σταδιακά την N. apis στην Ελλάδα. Κατόπιν έγινε η επιλογή των πρωτεϊνών που εξετάστηκαν ως πιθανοί φαρμακευτικοί στόχοι. Μεταξύ όλων των ορθόλογων πρωτεϊνών της N. apis και της N. ceranae με τον πρότυπο για τα μικροσπορίδια οργανισμό Encephalitozoon cuniculi επιλέγησαν τρείς πολύ σημαντικές για την φυσιολογία των μικροσποριδίων πρωτεΐνες: η Αμινοπεπτιδάση 2 της Μεθειονίνης, αναστολή της οποίας επιτυγχάνεται με την φουματζιλλίνη στην N. apis, η Απακετυλάση της Χιτίνης και η Αλδολάση της Διφωσφορικής Φρουκτόζης. Η πρωτοταγής δομή των συγκεκριμένων τριών πρωτεϊνών εμφανίζει μικρές μόνο διαφοροποιήσεις ανάμεσα στα δύο είδη μικροσποριδίων ενώ η τριτοταγής τους δομή έχει μεγάλη ομοιότητα. Ακολούθησαν τρεις αντιδράσεις PCR, μία για το αντίστοιχο γονίδιο κάθε πρωτεΐνης. Από τα αποτελέσματα των αντιδράσεων αυτών καθίσταται σαφές πως τα γονίδια που τις κωδικοποιούν δεν εκφράζονται εξ ίσου σε όλα τα δείγματα παρόλο που είχε διαπιστωθεί η μόλυνση τους από N. ceranae. Το γεγονός αυτό μας οδηγεί στο συμπέρασμα πως πιθανώς τα εν λόγω γονίδια εκφράζονται μονό σε συγκεκριμένα στάδια της ζωής του σπορίου, παραδείγματος χάριν, τη στιγμή της βλάστησης του, γεγονός που δικαιολογεί την έως σήμερα αδυναμία αποτελεσματικής αντιμετώπισής του παρασίτου. Τέλος πραγματοποιήθηκε μία in silico ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός ενός πιθανού φαρμάκου του μικροσπορίδιου Nosema ceranae.

In the present thesis, the Nosema apis and Nosema ceranae microspores were studied by employing both molecular genetics and bioinformatics methods. The Nosema species cause nosemosis, a disease which affects adult honeybees. Honeybee is considered to play an important role in economy and the ecosystem functioning, further pointing out the need to prevent the spread of nosemosis, which presents an increasingly serious problem in beekeeping. The current pharmaceutical approach to nosemosis using the antibiotic fumagillin is no longer effective, since fumagillin is mainly used against Nosema apis, the parasite of Western Apis mellifera in Europe and America. This is further supported by the more and more frequent detection of Nosema ceranae microspores, which infect the Asian bee Apis cerana and Apis mellifera, over the last decade, as it has been shown that fumagillin does not appear as effective against N. ceranae microspores. There is, therefore, an urgent need to find new means of managing nosemosis effectively. In this work, a methodological approach for identifying potentially new pharmaceutical targets against nosemosis is presented. In particular, fourteen samples of honeybees from diseased beehives with nosemosis symptoms from different parts of Greece were tested. Initially, the samples were examined using light microscopic procedures to detect their infection by the Nosema ceranae microspores, followed by quantification of the microspores they contained. Using molecular methods (PCR reactions) all samples infected by N. ceranae were characterized, which further confirms the finding that N. ceranae is gradually replacing N. apis in Greece. The proteins tested as potential pharmaceutical targets were then selected. Among all of the N. apis and N. ceranae proteins orthologous to the Encephalitozoon cuniculi, a microsporidian model organism, three proteins which play a vital role in the microsporidian physiology were selected: Methionine Aminopeptidase 2, which is known to inhibit fumagillin in N. apis, Chitin Deacetylase, and Fructose Bisphosphate Aldolase. The primary structure of the three proteins in the two Nosema species was found to vary slightly, while their tertiary structure was highly similar. Three cycles of PCR reactions, one for the corresponding gene of each protein, followed. On the basis of the results of the PCR reactions it is becoming clear that the genes coding for these three proteins are not expressed equally in all samples, although their infection with N. ceranae has been established. This leads to the suggestion that these genes are likely to be expressed exclusively at certain stages of the life cycle of N. ceranae, e. g. at the time of its germination, and this is probably the cause of the failed efforts to effectively treat the parasite so far. Finally, an in silico identification and characterization of potential drug targets for Nosema ceranae microspores was performed.