Πρωτεομική ανάλυση της μη-αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος σε in vitro μοντέλα πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων

Abstract

Η μη-αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος είναι η πιο κοινή ηπατική νόσος στον κόσμος, με παρουσία εώς και 30% στις ανεπτυγμένες χώρος. Η μη-αλκοολοκή λιπώδης νόσος του ήπατος χαρακτηρίζεται από την παρουσία ηπατικής στεάτωσης, απουσία αυξημένης κατανάλωσης αλκοόλ, και περιλαμβάνει ένα μεγάλο εύρος ασθενειών, από απλή στεάτωση εώς μη-αλκοολική στεατοηπατίτιδα, ίνωση, κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Η αιτία και η μηχανισμοί εξέλιξης της νόσου δεν είναι επαρκώς κατανοητοί. Τα τελευταία χρόνια ακολουθούνται πολυ-ομικές προσεγγίσεις, αλλά δεν υπάρχει – εν γνώση μας- έρευνα που να μελετά την νόσο σε επίπεδο κυτταρικής σηματοδότησης. Την ίδια στιγμή, οι φωσφο-πρωτεομικές μετρήσεις αναδεικνύονται σε σημαντικό εργαλείο για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων. In vitro έκθεση πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ελεύθερων λιπαρών οξέων και στεατογενικών φαρμάκων έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση συσσώρευσης ενδοκυτταρικών σταγονιδίων λίπους, όπως παρατηρείται και σε ασθενείς με μη-αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος και μη-αλκοολική στεατοηπατίτιδα. Η ενδοκυτταρική συσσώρευση σταγονιδίων λίπους διαπιστώθηκε μέσω high content screening: για τη χρώση των σταγονιδίων λίπους χρησιμοποιήθηκε η φθορίζουσα χρωστική Nile Red, ενώ για τη χρώση των πυρήνων το Hoechst 33342. Μετά από 24 ώρες έκθεση των πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων στα ελευθέρα λιπαρά οξέα και στα στεατογενικά φάρμακα, έγινε λύση των κυττάρων και απομόνωση των πρωτεϊνών. Μετρήθηκαν 19 φωσφορυλιωμένες πρωτεϊνες με χρήση της τεχνολογίας Luminex (πολλαπλή ELISA βασιζόμενη σε μικροσφαιρίδια). Βρέθηκε πως τα επίπεδα της AKT1 ήταν τρείς φορές λιγότερα από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Παρατηρήθηκαν επίσης μη-κανονικά μοτίβα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών IKBA, AKT1, WNK1, FAK1 και STAT6, οι περισσότερες από τις οποίες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό εκδήλωσης και εξέλιξης της νόσου.

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common liver condition in the world, with a prevalence of up to 30% in developed countries. NAFLD is defined by the presence of hepatic steatosis in the absence of excess alcohol consumption and represents a spectrum of disease, from simple steatosis and Non-Alcoholic Steatohepatitis (NASH) to fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The cause and disease progression mechanisms of NAFLD are still not completely understood. Researchers have tried to understand the disease through multi-omic approaches but there is no study -to our knowledge- exploring the signal transduction level, while phosphoproteomic measurements are becoming very important in drug discovery. In vitro exposure of primary human hepatocytes to increasing concentrations of free fatty acids (FFA) and steatogenic compounds results in increased intracellular accumulation of lipid droplets similar to those observed in patients with NAFLD and NASH. The formation of intracellular lipid droplets was verified using high content screening; lipid droplets were stained with Nile Red fluorescent probe and Hoechst 33342 was used for counterstaining cell nucleus. After a 24h treatment, we lysed the cells, measured the protein content of the lysates and adjusted the samples to the same concentration. After pooling 5 replicates of each FFA concentration, we measured 19 phosphorylated protein targets using Luminex technology (multiplex antibody-based ELISA). We found that the phosphorylation level of AKT1 was three-fold less than the control. Moreover, we show irregular phosphorylation patterns in IKBA, AKT1, WNK1, FAK1 and STAT6, most of which play a role in NAFLD/NASH mechanism.