Αξιολόγηση της αντιβιοϋμενικής δράσης του μηλεϊνικού οξέως έναντι του παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes

Abstract

Η προσκόλληση σε επιφάνειες, ο πολλαπλασιασμός και η ενσωμάτωση σε μια μήτρα εξωκυτταρικών πολυμερών ουσιών είναι μια φυσική τάση των μικροοργανισμών που τους επιτρέπει να επιβιώνουν σε εχθρικά περιβάλλοντα. Στη βιομηχανία τροφίμων τα βιοϋμένια αλλοιογόνων και παθογόνων μικροοργανισμών, τα οποία σχηματίζονται πάνω σε επιφάνειες που έρχονται σε επαφή με τρόφιμα, εμπλέκονται σε προβλήματα επιμόλυνσης των τροφίμων που οδηγούν στη μείωση της διάρκειας ζωής τους ή / και στη μετάδοση τροφιμογενών λοιμώξεων. Αντικείμενο της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της αντιβιοϋμενικής δράσης του μηλεϊνικού οξέως έναντι του τροφιμογενούς παθογόνου βακτηρίου Listeria monocytogenes. Στα πλαίσια προκαταρκτικών πειραματικών δοκιμών, αξιολογήθηκε η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου 14 στελεχών L. monocytogenes σε διαφορετικές τιμές pΗ (3, 5 και 7), συγκεντρώσεις μηλεϊνικού οξέως (3, 10 και 50 mM) και θερμοκρασίες (15 και 30 °C). O σχηματισμός βιοϋμενίου αξιολογήθηκε σε θρεπτικό ζωμό Βrain Ηeart Ιnfusion (ΒΗΙ) μετά από 48 h επώασης και εντός μικροσυστοιχιών πολυστυρενίου, χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους και η ποσοτικοποίηση βασίστηκε στη διαφορά μεταξύ των μετρήσεων της οπτικής πυκνότητας (580 nm) των εξετασθέντων στελεχών και του αρνητικού (μη εμβολιασμένου) δείγματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν πώς η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου εξαρτάται τόσο από το στέλεχος όσο και από τις δοκιμαζόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, επιλέχθηκαν δύο στελέχη L. monocytogenes (Β-169 και Β-454) για την περεταίρω αξιολόγηση της αντιβιοϋμενικής δράσης του μηλεϊνικού οξέως. Πιο συγκεκριμένα, η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου των δύο επιλεγμένων στελεχών του παθογόνου αξιολογήθηκε σε πλακίδια ανοξείδωτου χάλυβα και σε θρεπτικό ζωμό BHI, απουσία (0 Mm) και παρουσία μηλεϊνικού οξέως (50 mM), σε τιμές pH 5 και 7, στους 15 °C για συνολικά 144 h. Στις 3, 24, 72 και 144 h της επώασης τα προσκολλημένα, στα πλακίδια, κύτταρα αποκολλήθηκαν με τη μέθοδο του στροβιλισμού με γυάλινα σφαιρίδια και απαριθμήθηκαν με επίστρωση κατάλληλων διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων σε BHI άγαρ. Τα αποτελέσματα έδειξαν πώς υπήρξε σημαντική (P < 0.05) επίδραση του μηλεϊνικού οξέως στο σχηματισμό βιοϋμενίου του στελέχους Β-169 σε pH 5, όπου παρατηρήθηκε αξιοσημείωτα μικρότερη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου παρουσία του οργανικού οξέως (σε σχέση με απουσία αυτού). Ωστόσο, αντίστοιχες παρατηρήσεις δεν έγιναν στο pH 7, όπου το στέλεχος Β-169 παρουσίασε παρόμοια ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου παρουσία και απουσία μηλεϊνικού οξέως. Το στέλεχος Β-454 δε φάνηκε να επηρεάζεται από το μηλεϊνικό οξύ, παρουσιάζοντας, γενικά, μικρότερη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου σε σχέση με το πρώτο στέλεχος και στις δύο τιμές pH που εξετάστηκαν. Τέλος, αξιολογήθηκε η απολυμαντική δράση του μηλεϊνικού οξέως έναντι ώριμων βιοϋμενίων του παθογόνου L. monocytogenes. Για τον σκοπό αυτό, ώριμα βιοϋμένια (144 h) του παθογόνου, σχηματισθέντα σε πλακίδια ανοξείδωτου χάλυβα, παρουσία (50 mM) ή απουσία μηλεϊνικού οξέως (pH = 5), εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του οργανικού οξέως (0, 10, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 300 και 500 mM), του οποίου η απολυμαντική δράση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τόσο κλασικές μικροβιολογικές μεθόδους όσο και μετρήσεις αγωγιμότητας. Σύμφωνα με τα ληφθέντα αποτελέσματα, η απολυμαντική δράση του μηλεϊνικού οξέως φάνηκε να εξαρτάται από το εξεταζόμενο στέλεχος αλλά και την προηγούμενη έκθεση του σχηματισθέντος βιοϋμενίου στο οργανικό οξύ. Πιο συγκεκριμένα, το βιοϋμένιο του στελέχους Β-196, το οποίο σχηματίστηκε παρουσία μηλεϊνικού οξέως, παρουσίασε αυξημένη ανθεκτικότητα κατά την απολύμανση με το οργανικό οξύ σε συγκέντρωση 10 mΜ, σε σχέση με το βιοϋμένιο το οποίο σχηματίστηκε απουσία του οξέως. Από την άλλη πλευρά, αντίστοιχες ή παρόμοιες παρατηρήσεις δεν έγιναν για το στέλεχος Β-454. Επιπρόσθετα, συγκεντρώσεις μηλεϊνικού οξέως μεγαλύτερες των 20 mM φάνηκε να είναι οι πιο αποτελεσματικές για την καταπολέμηση των βιοϋμενίων του παθογόνου. Εν κατακλείδι, το μηλεϊνικό οξύ παρουσιάζει αξιόλογο αντιβιοϋμενικό δυναμικό έναντι του παθογόνου L. monocytogenes τόσο σε επίπεδο σχηματισμού βιοϋμενίων όσο και απολύμανσης αυτών, με την ακριβή του δράση, ωστόσο, να εξαρτάται σημαντικά από το στέλεχος του βακτηρίου και τις συνθήκες εφαρμογής. Επιπλέον, φαινόμενα προσαρμογής και ενισχυμένης ανθεκτικότητας των κυττάρων παθογόνων μικροοργανισμών κατά την έκθεσή τους στο οργανικό οξύ ενδέχεται να υπάρξουν και, ως εκ τούτου, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την εφαρμογή στρατηγικών απολύμανσης με στόχο την εξάλειψη βιοϋμενίων από τον εξοπλισμό επεξεργασίας τροφίμων.

It is a natural tendency of microorganisms to attach to wet surfaces, to multiply and to embed themselves in a matrix composed of extracellular polymeric substances that they produce, forming a biofilm, in order to protect and survive in hostile environments. In the food industry, biofilms of both spoilage and pathogenic bacteria, formed on food-contact surfaces, are related to problems of food contamination, which lead to reduced shelf-life of products or / and foodborne disease transmission. The objective of this study was to evaluate the antibiofilm activity of maleic acid against the foodborne bacterial pathogen Listeria monocytogenes. The biofilm-forming ability of 14 L. monocytogenes strains was evaluated by preliminary experimental tests at different pH values (3, 5 and 7), maleic acid concentrations (0, 3, 10 and 50 mM) and temperatures (15 and 30 °C). Biofilm formation was evaluated in Brain Heart Infusion (BHI) broth after 48 h of incubation in polystyrene microtiter plates, using crystal violet staining, while its quantification was based on the differences between the optical density (580 nm) measurements of the tested strains and the negative (uninoculated) samples. The obtained results demonstrated that biofilm formation was strain-dependent and affected by all the tested environmental parameters. Base on the preliminary results, two strains of L. monocytogenes (B-169 and B-454) were selected for further evaluation of the antibiofilm activity of maleic acid. More specifically, the biofilm-forming ability of the two selected strains was evaluated on stainless steel coupons, in BHI broth with maleic acid (50 mM) or without maleic acid (0 mM), at pH values of 5 and 7, at 15 °C and for a total time period of 144 h. At 3, 24, 72 and 144 h of incubation, cells attached to stainless steel coupons were retrieved using the bead vortexing method and enumerated (by plating of appropriate serial decimal dilutions) on BHI agar. Results showed a significant (P < 0.05) effect of maleic acid on the biofilm-forming ability of strain B-169 at pH 5, where a significantly lower biofilm-forming ability was observed at 50 mM, compared to 0 mM. However, a similar observation was not made at pH 7, where strain B-169 formed similar biofilms at 0 and 50 mM of maleic acid. Strain B-454, on the other hand, did not appear to be affected by maleic acid, demonstrating an overall lower biofilm-forming ability than strain B-169 at both tested pH values. Finally, the disinfection efficacy of maleic acid against formed L. monocytogenes biofilms was investigated. For this purpose, mature biofilms (144 h) of the pathogen, formed on stainless steel, in the absence (0 mM) or presence (50 mM) of maleic acid (pH = 5), were exposed to different concentrations of this organic acid (0, 10, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 300, 500 mM) and the surviving biofilms were evaluated either directly through microbiological analyses (i.e. plating of appropriate decimal dilutions on BHI agar) or indirectly using conductance measurements. According to the results, the disinfection efficacy of maleic acid appeared to depend on the tested strains, but also on the previous pathogen’s exposure (i.e. during biofilm formation) to the organic acid. In particular, when the biofilm of strain B-169 was formed in the presence of maleic acid, it exhibited an enhanced resistance during subsequent exposure to 10 mM solution of the organic acid, compared to its non-adapted counterpart (i.e. biofilm formed in the absence of maleic acid). On the other hand, similar observations were not made for strain B-454. Furthermore, maleic acid concentrations higher than 20 mM appeared to be the most effective against biofilms of L. monocytogenes. In conclusion, based on the findings of the present study, maleic acid exhibits a remarkable antibiofilm potential against the foodborne bacterial pathogen L. monocytogenes, both in terms of biofilm formation and disinfection, with its exact activity, however, being considerably dependent on strain and environmental conditions. In addition, phenomena of bacterial adaptation and enhanced resistance during exposure of foodborne pathogens to weak organic acids, may be encountered and should, thus, be taken into consideration when applying acidic decontamination strategies to eradicate foodborne pathogens from food processing equipments.