Μελέτη της παραγωγής πολυολών κατά την ανάπτυξη της ζύμης Yarrowia lipolytica σε υπόστρωμα γλυκερόλης

Abstract

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της ικανότητας της ζύμης Yarrowia lipolytica να αναπτύσσεται σε υδρόφιλο υπόστρωμα χαμηλού κόστους και συγκεκριμένα σε γλυκερόλη, η οποία είναι παραπροϊόν της βιομηχανικής παραγωγής βιοκαυσίμου (biodiesel). Ειδικότερα, η ικανότητα της ζύμης να μεταβολίζει την γλυκερόλη προς παραγωγή βιομάζας, δευτερογενών μεταβολιτών όπως μικροβιακό λίπος και ενδοπολυσακχαρίτες, προϊόντα με ισχυρές αντιοξειδωτικές ικανότητες, κατάλληλα για χρήση τόσο στη φαρμακοβιομηχανία όσο και στη βιομηχανία τροφίμων, καθώς και διαφόρων μεταβολικών προϊόντων (π.χ. μαννιτόλη, αραβιτόλη, ερυθριτόλη). Απώτερος σκοπός της μελέτης αυτής είναι η αριστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας, με στόχο τη μέγιστη παραγωγή μαννιτόλης. Οι καλλιέργειες διενεργήθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος και pH και σε σταθερές συνθήκες ανάδευσης και θερμοκρασίας. Η γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν διαχωρισμένη και καθαρότητας 88% και 100% κατά βάρος. Στην πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη του γένους Yarrowia lipolytica LMBF Υ-46 και LMBF Υ-47. Πραγματοποιήθηκαν υγρές καλλιέργειες, ασυνεχούς και συνεχούς τύπου, σε αναδευόμενες φιάλες Erlenmeyer των 250mL, χρησιμοποιώντας ως πηγή άνθρακα γλυκερόλη, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (40 g L-1, 60 g L-1, 80 g L-1 και 120 g L-1) με περιοριστικό παράγοντα αύξησης το άζωτο σε συνθήκες καλλιέργειες (30ºC, pH 3.0 - 7.0). Έγινε προσδιορισμός του ξηρού βάρους βιομάζας, πραγματοποιήθηκε μέτρηση της βιομάζας με ξήρανση και στη συνέχεια εκχύλιση των λιπιδίων για τον ποσοτικό προσδιορισμό τους (Papanikolaou et al., 2003). Διαπιστώθηκε επίσης η παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών, ο προσδιορισμός των οποίων έγινε με DNS (Miller, 1959). Η παραγωγή μαννιτόλης, η κατανάλωση των σακχάρων αλλά και ο ποιοτικός προσδιορισμός των παραγόμενων ενδοπολυσακχαριτών προσδιορίστηκε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Η παρούσα μελέτη χωρίστηκε σε τέσσερα πειραματικά στάδια. Στο πρώτο πείραμα εξετάστηκαν τα δυο στελέχη σε υγρές καλλιέργειες με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 40 g L-1 σε διαφορετικές τιμές pH (3.0, 4.0, 5.0, 6.0 και 7.0). Η συγκριτική τους αξιολόγηση βασίστηκε στην ικανότητα τους να καταναλώνουν την γλυκερόλη και να την μετατρέπουν σε βιομάζα, ενδοπολυσακχαρίτες και δευτερογενείς μεταβολίτες. Οι μετρήσεις έδειξαν ότι και τα δυο στελέχη προσαρμόστηκαν στο υπόστρωμα της γλυκερόλης, παράγοντας ικανοποιητικές ποσότητες βιομάζας, ενώ το στέλεχος LMBF Y-46 παρατηρήθηκε ότι παρήγαγε μεγαλύτερες ποσότητες πολυολών. Στο δεύτερο πείραμα, έγινε σύγκριση αποτελεσμάτων για υπόστρωμα καθαρής και ακάθαρτης γλυκερόλης, συγκέντρωσης 40 g L-1 για pH 3.5 για το στέλεχος LMBF Y-46. Στο τρίτο πείραμα επιλέχτηκε το στέλεχος με την μεγαλύτερη παραγωγή πολυολών και συγκεκριμένα μαννιτόλης, 19.6 g L-1 στις 48h σε pH 3.0. Μελετήθηκε περαιτέρω σε υγρές καλλιέργειες με υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις 60 g L-1, 80 g L-1 και 120 g L-1 σε pH 3.5. Παρατηρήθηκε ωστόσο, υψηλότερη παραγωγή μαννιτόλης, 21.7 g L-1 στις 312h, σε συγκέντρωση υποστρώματος 120 g L-1. Στο τέταρτο πείραμα μελετήθηκε σε fed batch καλλιέργεια το στέλεχος LMBF Y-46 σε υπόστρωμα βιομηχανικής γλυκερόλης, συγκέντρωσης 40 g L-1 και παρατηρήθηκε ευνοϊκή επίδραση του νέου στείρου θρεπτικού υλικού στην παραγωγή των προϊόντων. Λέξεις Κλειδιά: Ζύμες, βιομηχανική γλυκερόλη, μαννιτόλη, πολυόλες

The purpose of this study is to investigate the ability of Yarrowia lipolytica to grow on a low-cost hydrophilic substrate, particular glycerol, which is a by-product of the industrial production of biodiesel. In particular, the ability of the yeast to metabolize glycerol to produce biomass, secondary metabolites such as single cell oil and intra-cellular polysaccharides, products with strong antioxidant capabilities, suitable for use in both the pharmaceutical and food industries as well as various metabolic products (e.g., mannitol, arabitol, erythritol). The ultimate purpose of this study is to optimize the cultivation conditions to maximize the production of mannitol. The fermentation were performed at different substrate concentrations and pH and at constant stirring and temperature. The glycerol used was separated and had 88% and 100% purity by weight. In the experimental procedure, strains of the genus Yarrowia lipolytica LMBF Y-46 and LMBF Y-47 were used. Liquid, discontinuous and continuous cultures were conducted in Erlenmeyer flasks 250mL, using glycerol as the carbon source at different concentrations (40 g L-1, 60 g L-1, 80 g L-1 and 120 g L-1, with nitrogen limiting factor in crop conditions (30°C, pH 3.0 – 7.0). Dry biomass weight was determined, biomass was measured by drying and then extraction of the lipids for quantitative determination (Papanikolaou et al., 2003). The production of intra-cellular polysaccharides, determined by DNS (Miller, 1959), was also found. Production of mannitol, consumption of sugars as well as qualitative determination of the produced intra-cellular polysaccharides was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). This study was divided into four experimental stages. In the first experiment, the two strains were examined in liquid cultures with industrial glycerol substrate, concentration 40 g L-1 at different pH (3.0, 4.0, 5.0, 6.0 and 7.0). The comparative assessment was based on their ability to consume glycerol and convert it into biomass, intra-cellular polysaccharides and secondary metabolites. The results showed that both strains were adapted to the glycerol substrate producing sufficient quantities of biomass, whereas the LMBF Y- 46 was observed to produce larger amounts of polyols. In the second experiment, we had a comparison of results for a pure and crude glycerol substrate, the concentration was 40 g L-1 and pH was 3.5 for the LMBF Y-46 strain. In the third experiment the strain with the highest production of polyols, particular mannitol, 19.6 g L-1 at 48h at pH 3.0 was selected. It was further studied in liquid cultures with industrial glycerol substrate at different concentrations of 60 g L-1, 80 g L-1 and 120 g L-1 at pH 3.5. Higher mannitol production, 21.7 g L-1 at 312h, at 120 g L-1 substrate concentration, was observed. In the fourth experiment, the LMBF Y-46 strain was cultured in a fed batch culture of 40 g L-1 industrial glycerol substrate. A favorable effect of the new sterile nutritional material on the production of the products has been observed. Keywords: Yeasts, industrial glycerol, mannitol, polyols