Μελέτη της εσωτερικοποίησης προσαρμοσμένων σε συνθήκες ήπιας καταπόνησης κυττάρων του μικροοργανισμού Salmonella enterica spp. enterica serovar Enteritidis σε φυλλώδη λαχανικά

Abstract

Ο παθογόνος μικροοργανισμός Salmonella spp. δύναται να εποικίσει φυλλώδη λαχανικά είτε επιφανειακά (προσκόλληση) είτε διεισδύοντας στο εσωτερικό τους (εσωτερικοποίηση), φαινόμενο που καθιστά τις συμβατικές μεθόδους εξυγίανσης ανεπαρκείς. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της επίδρασης α) του επιπέδου του αρχικού εμβολίου και β) του ιστορικού (έκθεση σε ήπια καταπόνηση) κυττάρων Salmonella Enteritidis στην ικανότητα εσωτερικοποίησης τους σε τέσσερα φυλλώδη λαχανικά. Σπανάκι, μαρούλι, ιταλικά χόρτα και ρόκα εμβολιάστηκαν με τη μέθοδο της εμβάπτισης με προσαρμοσμένα και μη προσαρμοσμένα (7, 6, 5, 4, 3 log CFU/mL) σε συνθήκες ήπιας καταπόνησης κύτταρα Salmonella Enteritidis. Ειδικότερα, η προσαρμογή των κυττάρων του παθογόνου έλαβε χώρα στις παρακάτω συνθήκες: α) όξινη καταπόνηση (1% γλυκόζη, 24 h στους 37 °C), β) ψυχρή καταπόνηση (7 ημέρες στους 4 °C), γ) συνθήκες έλλειψης θρεπτικών συστατικών (0.85% NaCl με pH 6.6, 48 h στους 37 °C) και δ) συνθήκες ξήρανσης (1.5 h στους 42 °C, 4 ημέρες στους 21 °C). Στη συνέχεια τα εμβολιασμένα λαχανικά συντηρήθηκαν υπό αερόβιες συνθήκες για 2 h και 48 h στους 5oC και 20oC (n=2x2). Με το πέρας της συντήρησης προσδιορίστηκε ο εσωτερικοποιημένος πληθυσμός του Salmonella. ύστερα από εξυγίανση της φυλλικής επιφάνειας με 1% w/v AgNO3. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ακόμη και χαμηλή αρχική συγκέντρωση του παθογόνου (3 log CFU/mL) ήταν επαρκής για να εσωτερικοποιείται ο παθογόνος σε φυλλώδη λαχανικά. Το επίπεδο, δε, του αρχικού εμβολίου του Salmonella φάνηκε να επηρεάζει την παραλλακτικότητα στην εσωτερικοποίηση του παθογόνου μεταξύ των διαφορετικών λαχανικών. Πιο συγκεκριμένα, αρχικό εμβόλιο 7.0 και 3.0 log CFU/mL είχε ως αποτέλεσμα εσωτερικοποίηση 3.0-4.5 και 1-1.5 log CFU/g κυττάρων Salmonella αντίστοιχα. Προηγούμενη έκθεση των βακτηριακών κυττάρων σε συνθήκες ήπιας καταπόνησης επηρέασε τόσο την ικανότητα εσωτερικοποίησής τους, όσο και την ικανότητα μετέπειτα ανάπτυξής τους στα λαχανικά. Ιδιαίτερα, προηγούμενη έκθεση του παθογόνου σε συνθήκες ξήρανσης δεκαπλασίασε τον πληθυσμό των εσωτερικοποιημένων κυττάρων. Προσαρμοσμένα σε συνθήκες ξήρανσης και μη προσαρμοσμένα κύτταρα του παθογόνου, παρουσίασαν ικανότητα εσωτερικοποίησης 10-50% και 1-4% (του αρχικού πληθυσμού) αντίστοιχα. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμβάλλουν στην πληρέστερη περιγραφή και κατανόηση του φαινομένου της εσωτερικοποίησης του παθογόνου Salmonella spp. στα φυλλώδη λαχανικά και στην καλύτερη εκτίμηση της επικινδυνότητάς του.

Salmonella colonizes or penetrates leafy greens, phenomenon known as internalization. The ability of internalized bacteria to evade common disinfection practices poses a well-established risk. Our aim was to study the effect of: i) inoculum size and ii) prior adaptation of Salmonella to sublethal stresses, on the internalization of the pathogen in four leafy vegetables. Spinach, lettuce, arugula and endive were inoculated by immersion with adapted and non-adapted (7, 6, 5, 4, 3 log CFU/mL) Salmonella Enteritidis and subsequently stored at 5oC and 20oC for 2h and 48h (n=2x2). Adaptation of Salmonella was performed under the following sublethal stresses: i) acid stress (1% glucose, 24h at 37oC), ii) cold stress (7d at 4oC), iii) starvation (0.85% NaCl of pH 6.6, 48h at 37oC) and iv) desiccation (1.5h at 42oC, 4d at 21oC). Population of internalized Salmonella (after surface decontamination with 1% w/v AgNO3) was assessed on selective media. According to results, even low initial bacterial inoculum was adequate in order internalization of Salmonella in leafy vegetables to occur. However, the higher the initial inoculum, the higher the variability in internalization of Salmonella among vegetables. In particular, non-adapted Salmonella inoculum of 7.0 and 3.0 log CFU/mL resulted in 3.0-4.5 and 1.0-1.5 log CFU/g internalized cells respectively. Moreover, adaptation of the pathogen to mild stresses affected both its internalization ability as well as its subsequent growth capacity in the vegetables. Adapted to desiccation Salmonella showed increased internalization ability by approximately ten-fold manifested by the higher internalization rate (10-50%) compared to non-adapted Salmonella (1-4%). Our findings contribute to elucidate Salmonella colonization and particularly internalization phenomenon in leafy vegetables and therefore could be supportive material in quantitative risk assessment of pathogens in fresh produce sector.