Επίδραση των διαστελεχιακών αλληλεπιδράσεων στη μεταβολή του πληθυσμού του παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes σε μαλακά τυριά και στην επιβίωσή του μετά από έκθεση σε συνθήκες προσομοίωσης του γαστρικού συστήματος

Abstract

Η συνύπαρξη διαφορετικών στελεχών του παθογόνου Listeria monocytogenes στο ίδιο τρόφιμο είναι πιθανό να επηρεάσει την ικανότητα ανάπτυξής τους και κατ’ επέκταση τα τελικά επίπεδα πληθυσμού, τη στιγμή της κατανάλωσης και την ανθεκτικότητά τους κατά την διάρκεια της πέψης. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε την επίδραση της συγκαλλιέργειας στην ανάπτυξη προσαρμοσμένων σε τυρί και μη προσαρμοσμένων στελεχών L. monocytogenes σε Ricotta και Camembert και στην μείωσή τους μετά την έκθεσή τους σε συνθετικό γαστρικό υγρό. Η ανάπτυξη 4 προσαρμοσμένων σε τυρί και μη προσαρμοσμένων στελεχών L. monocytogenes προσδιορίστηκε σε μονές και μικτές καλλιέργειες των δυο στελεχών (1:1 αναλογία στελεχών). Ricotta και Camembert (10g) εμβολιάστηκαν με 2.5-3 log CFU/g από τις καλλιέργειες. Τα στελέχη που επιλέχθηκαν ήταν ανθεκτικά σε διαφορετικά αντιβιοτικά για την επίτευξη επιλεκτικής καταμέτρησης σε υπόστρωμα Tryptic Soy Agar + αντιβιοτικό. Η προσαρμογή των στελεχών έγινε σε ζωμό τυριού (1:1 τυρί:Maximum Recovery Diluent) για 48h στους 7oC, πριν τον εμβολιασμό των τυριών. Η προσαρμογή στο τυρί έγινε με στόχο την καλύτερη αξιολόγηση των διαστελεχιακών αλληλεπιδράσεων, περιορίζοντας την πιθανή επιρροή του μικροπεριβάλλοντος του τυριού. Τα τυριά μετά τον εμβολιασμό συντηρήθηκαν στους 7oC, υπό αερόβιες συνθήκες. Έπειτα ακολούθησε έκθεση 3 συνδυασμών στελεχών (2 σε Ricotta και 1 σε Camembert) σε συνθετικό γαστρικό υγρό (pH 2) για 120 λεπτά. Η καταμέτρηση έγινε σε υπόστρωμα Tryptic Soy Agar + αντιβιοτικό, και επιπλέον πραγματοποιήθηκε εμπλουτισμός και καταμέτρηση του pH καθόλη τη διάρκεια της έκθεσης. Η ανάπτυξη των στελεχών τους L. monocytogenes και των συγκαλλιεργειών στις οποίες έγινε προσαρμογή σε τυρί καθώς και σε αυτές που δεν έγινε, ήταν παρόμοια (p≥0.05), τόσο στη Ricotta όσο και στο Camembert, με εξαίρεση τον συνδυασμό C5 – ScottA, στο τυρί Ricotta, που η προσαρμογή εξάλειψε τον ανταγωνισμό των στελεχών. Στα προσαρμοσμένα στο τυρί στελέχη, οι μονοκαλλιέργειες όσο και οι συγκαλλιέργειες παρουσίασαν συντομότερη φάση προσαρμογής, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στελέχη στα οποία δεν έγινε προσαρμογή. Συγκεκριμένα, το προσαρμοσμένο στο τυρί C5 παρουσίασε αύξηση 1.5 log CFU/g or cm2 τη 2η μέρα συντήρησης. Το ίδιο στέλεχος στο οποίο δεν έγινε προσαρμογή, μπήκε στην εκθετική φάση την 4η μέρα. Σημαντικές διαφορές (P<0.05) παρατηρήθηκαν στην ανάπτυξη ορισμένων στελεχών σε συγκαλλιέργεια σε σχέση με την αντίστοιχη μονοκαλλιέργειά τους. Το προσαρμοσμένο σε τυρί και μη προσαρμοσμένο στέλεχος 6179 στην μονοκαλλιέργεια έφτασε τα 7.2 log CFU/g, ενώ στη συγκαλλιέργεια έφτασε τα 5.6 log CFU/g, υποδηλώνοντας αναστολή ανάπτυξης, όταν ο ανταγωνιστής του έφτασε το μέγιστο επίπεδο ανάπτυξης (7.9 log CFU/g). Κατά την έκθεση εμβολιαμένων τυριών Ricotta με τους συνδυασμούς ScottA – PL25 και C5 – ScottA, το στέλεχος ScottA, παρουσίασε αυξημένη ανθεκτικότητα ανεξαρτήτως παρουσίας ανταγωνισμού, καθώς στον 1ο συνδυασμο δεν υπήρχε ενώ στον 2ο υπήρχε. Το Camembert, αποτέλεσε μη ευνοϊκό υπόστρωμα για τους συνδυασμούς στελεχών που καλλιεργήθηκαν σε αυτό, όσον αφορά την οξεοανθεκτικότητά τους. Τέλος, η διάρκεια της συντήρησης παίζει ρόλο στην οξεοανθεκτικότητα των στελεχών καθώς, τα στελέχη που ήταν στη στατική φάση κατάφερναν να επιβιώσουν σε μεγαλύτερους πληθυσμούς συγκριτικά με εκείνα που ήταν στην εκθετική φάση ανάπτυξής τους. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν πώς το τυρί ως υπόστρωμα καθορίζει την έκβαση των διαστελεχιακών αλληλεπιδράσεων και την κυριαρχία ορισμένων στελεχών L. monocytogenes στα τρόφιμα αλλά και την ανθεκτικότητα τους σε όξινη καταπόνηση, όπως αυτή του χαμηλού pH του στομάχου.

The coexistence of different L. monocytogenes strains in the same food sample might influence their growth capacity and thus, the final levels at the time of consumption and their resistance during digestion. The aim of this study was to investigate the inter-strain interactions on the growth of matrix-adapted and non-adapted L. monocytogenes on Ricotta and Camembert cheeses and their reduction after exposure to synthetic gastric fluid. Ricotta (10g) and Camembert (6x2 cm2 pieces) cheeses were inoculated at approximately 2.5 log CFU/g or cm2 with four matrix-adapted and non-adapted L. monocytogenes strains (serotypes 1/2a, 1/2b, 4b), in single and two-strain cultures (1:1 strain ratio). Strains were selected as resistant to different antibiotics for their selective enumeration on Tryptic Soy Agar supplemented with Yeast Extract and antibiotic. Adaptation of cells was performed in cheese broth (1:1 cheese in Maximum Recovery Diluent) for 48h at 7oC, before inoculation of cheeses. Adaptation aimed to evaluate exclusively the inter-strain interactions, eliminating the potential impact of cheese microenvironment on strain-to-strain interactions. Cheeses were stored aerobically at 7oC. Then 3 combinations of strains (2 in Ricotta and 1 in Camembert) were exposed to synthetic gastric fluid (pH 2) for 120 minutes. Their selective enumeration performed on a Tryptic Soy Agar + antibiotic substrate. Also, enrichment and pH-measures were made throughout the exposure. Adaptation of L. monocytogenes strains on Ricotta and Camembert resulted in similar (p≥0.05) growth responses, with the exception of combination C5 - ScottA, in Ricotta cheese, where the adaptation eliminated the competition. Both single and co-culture adapted strains, had sorter lag phase than the non-adapted ones. Particularly, adapted strain C5 showed growth of 1.5 log CFU/g or cm2 on the 2nd day of storage, compared to the non-adapted, which entered the exponential phase on day 4. Differences (p<0.05) in growth kinetics of some strains were observed when grown singly compared to the same strain in co-culture. Adapted and non-adapted singly cultured strain 6179 increased to 7.2 log CFU/g, whereas in co-culture remained at 5.6 log CFU/g, suggesting growth inhibition (p<0.05), when its competitor reached the maximum growth (7.9 log CFU/g). In the exposure of Ricotta inoculated with the ScottA - PL25 and C5 - ScottA combinations, the ScottA strain showed increased resistance irrespective of the presence of competition, since the first combination did not show competition while in the second there was. Camembert was an unfavorable substrate for the combinations of strains grown in it, in terms of their resistability. Finally, the duration of maintenance plays an important role in the resistances of the strains, as the cells in stationary phase managed to survive in larger populations compared to those in the exponential phase. The results reveal how cheese matrix determines the outcome of inter-strain interactions and therefore could assist in explaining the dominance and acid resistance of certain strains in foods of safety concern for L. monocytogenes.