Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η πορεία της ζύμωσης της ελιάς ποικιλίας Καλαμών με τη χρήση καλλιεργειών εκκίνησης από ζύμες που είχαν προηγουμένως απομονωθεί και ταυτοποιηθεί από ζυμώσεις φυσικής μαύρης ελιάς. Τα στελέχη των ζυμών που χρησιμοποιήθηκαν χαρακτηρίστηκαν από προηγούμενη εργασία για το in vitro προβιοτικό δυναμικό τους και ήταν: Pichia kluyveri Υ5, Metschnikowia pulcherrima Y14, Pichia guilliermondii Y22, Saccharomyces cerevisiae Y34 και Candida molendinolei Y45. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν δύο ενοφθαλμισμοί της άλμης με τα ανωτέρω στελέχη ζυμών σε μονοκαλλιέργεια, ο πρώτος έγινε την 7η ημέρα της ζύμωσης ενώ ο δεύτερος την 130η ημέρα.
Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη της επιβίωσης των προαναφερθέντων στελεχών ζυμών, σε διάφορα χρονικά διαστήματα της ζύμωσης, με χρήση μοριακών τεχνικών. Έγινε γενετικός διαχωρισμός των ζυμών που απομονώθηκαν από την άλμη και τον καρπό σε συγκεκριμένα στάδια της ζύμωσης (7η, 70η και 150η ημέρα) που αντιστοιχούν στο αρχικό, ενδιάμεσο και τελικό σημείο της επεξεργασίας. Σε αυτά τα στελέχη πραγματοποιήθηκε ομαδοποίηση με τη μέθοδο της rep-PCR και τη χρήση του εκκινητή GTG5 που ενισχύει παλλίνδρομες διασκορπισμένες αλληλουχίες στο γονιδίωμα των ζυμών. Η ομαδοποίηση των στελεχών με βάση το ηλεκτροφορητικό τους προφίλ πραγματοποιήθηκε με χρήση του προγράμματος Bionumerics. Παράλληλα έγιναν δειγματοληψίες σε τακτά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της ζύμωσης για την απαρίθμηση της δυναμικής του πληθυσμού των οξυγαλακτικών βακτηρίων, ζυμών και εντεροβακτηρίων σε επιλεκτικά υποστρώματα. Παράλληλα καταγράφηκε η μεταβολή της τιμής του pH και της ογκομετρούμενης οξύτητας κατά την διάρκεια της επεξεργασίας.
Παρατηρήθηκε ότι οι ζύμες που απομονώθηκαν κατά τη διάρκεια του πειράματος παρουσιάζουν έντονη ετερογένεια στο πρώτο στάδιο της ζύμωσης (7η ημέρα), ενώ κατά το ενδιάμεσο (70η ημέρα) και το τελικό στάδιο (150η ημέρα) παρατηρούμε το σχηματισμό μεγάλων ομάδων ζυμών με βάση τα αποτελέσματα των αντίστοιχων δενδρογραμμάτων. Είναι χαρακτηριστικό ότι τα επιλεγμένα στελέχη ζυμών που χρησιμοποιήθηκαν ως καλλιέργειες εκκίνησης δεν ανιχνεύθηκαν στο τέλος της ζύμωσης ενώ κανένα στέλεχος από τις επιλεγμένες καλλιέργειες εκκίνησης δεν ανιχνεύθηκε στην άλμη και στον καρπό της ελιάς κατά την 70η ημέρα της ζύμωσης, καθώς το γενετικό τους προφίλ διέφερε από τα γενετικά προφίλ των υπολοίπων ζυμών που απομονώσαμε πιθανότατα λόγω ανταγωνισμού από την αυτόχθονη μικροχλωρίδα της ελιάς.
Σχετικά με τον πληθυσμό των οξυγαλακτικών βακτηρίων στην άλμη, αρχικά κυμάνθηκε σε 6,5-7,0 log CFU/ml, στη συνέχεια αυξήθηκε σε 8,0 log CFU/ml και σταθεροποιήθηκε σε 6,0 log CFU/ml στο τέλος της επεξεργασίας. Τα εντεροβακτήρια μηδενίστηκαν από τις πρώτες ημέρες της ζύμωσης τόσο στην ελιά όσο και στην άλμη, με τη διαφορά ότι ο αρχικός πληθυσμός αυτών στην ελιά ήταν περίπου 7,0 – 8,0 log CFU/g ενώ στην άλμη 4,0-5,0 log CFU/ml. Τέλος, σχετικά με τη μεταβολή του πληθυσμού των ζυμών στην άλμη παρουσιάστηκε αύξηση της τάξης του ενός λογαρίθμου αμέσως μετά τον εμβολιασμό και από 4 log CFU/ml έφτασε σε 5 log CFU/ml, με ορισμένες περιπτώσεις να αγγίζει και τους 6,0 log CFU/ml. Στην ελιά ο πληθυσμός ξεκίνησε και πάλι από τους 4,0 log CFU/g αυξήθηκε κατά έναν λογάριθμο και κατέληξε τις τελευταίες μέρες να κυμαίνεται στα αρχικά του επίπεδα. Η τιμή του pH κυμάνθηκε από 5,5 ± 0.5 κατά μέσο όρο στην έναρξη της ζύμωσης σε 4,0 ± 0,2 στο τέλος της επεξεργασίας, ενώ η ογκομετρούμενη οξύτητα αυξήθηκε σταδιακά σε 0,5 ± 0,1 % (β/ο) γαλακτικό οξύ κατά μέσο όρο στο τέλος της ζύμωσης (150 ημέρες).
In the present study, the inoculated fermentation of natural black Kalamata olives with selected strains of yeasts as starter cultures was studied. The selected yeast strains used in the fermentations were: Pichia kluyveri Y5, Metschnikowia pulcherrima Y14, Pichia guilliermondii Y22, Saccharomyces cerevisiae Y34, and Candida molendinolei Y45. In particular, yeasts were inoculated as monocultures in the brines and their survival was monitored using molecular techniques at specific time intervals, namely beginning (day 7), middle (day 70), and end (day 150) of fermentation. The isolated strains were grouped by the rep-PCR method using the GTG5 primer that amplifies pulsed-scattered sequences in the yeast genome. At the same time, sampling was carried out at regular time intervals during fermentation to allow for the determination of the population dynamics of lactic acid bacteria, yeasts and enterobacteria together with changes in pH values and titratable acidity in the brines.
Results showed that the yeasts isolated during the experiment showed a strong heterogeneity in the early stage of fermentation (day 7), whereas in the middle and final stages of fermentation the formation of large groups of yeasts was observed. None of the inoculated yeast strains survived in any fermentation process due to intense competition from the indigenous microbiota of olives. Regarding the population dynamics of lactic acid bacteria in the birnes, they were enumerated at 6.5-7.0 log CFU/ml at the beginning of fermentation, followed by a rapid increase to 8.0 log CFU/ml in the first 10 days of the process and finally stabilized at 6.0 log CFU/ml. A different profile for lactic acid bacteria was observed on olive fruits where the population was maintained stable at 7.0-8.0 log CFU/g with slight variations throughout the process. The counts of enterobacteria declined rapidly from the onset of fermentation and this microbial group could not be enumerated in both brine and olives after 50 days in the majority of fermentation vessels. It needs to be noted that the initial population of enterobacteria was higher on olives (7.0-8.0 log CFU/g) compared to the brine (4.0-5.0 log CFU/ml). Concerning the population changes in yeasts during the process, an increase of 1 log cycle was observed right after the inoculation, from 4.0 to 5.0 log CFU/ml, whereas in certain vessels yeasts were enumerated at 6.0 log CFU/ml. In the case of olive fruits, the initial yeast population was 4.0 log CFU/g and maintained at this level throughout the process. Finally, the values of pH changed from 5.5 to 4.0 at the beginning and end of fermentation, respectively, whereas titratable acidity gradually increased to 0.5 g of lactic acid/100 ml of brine at the end of all processes.
