Ανάπτυξη συστοιχίας κυτταρικών σειρών και διερεύνηση της διαφορικής απόκρισης σε βιοκτόνα

Abstract

Στη γεωργική πρακτική έχει παρατηρηθεί εκτεταμένη χρήση φυτοπροστατευτικών ουσιών και κατά συνέπεια απαιτούνται αξιόπιστες μέθοδοι για την ανίχνευση υπολειμμάτων τους στα τρόφιμα. Μια μεγάλη κατηγορία φυτοπροστατευτικών ουσιών που χρησιμοποιούνται στην αγροτική παραγωγή είναι τα εντομοκτόνα και ακαρεοκτόνα (βιοκτόνα). Υπολείμματα τέτοιων ουσιών συναντώνται συχνά σε πολλές κατηγορίες τροφίμων και ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των υπολειμμάτων αυτών των ουσιών έχει περιοριστεί στη χρήση κλασσικών τεχνικών της αναλυτικής χημείας, όπως χρωματογραφικών και φασματοσκοπικών τεχνικών. Παρόλο που οι μέθοδοι αυτοί παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία, είναι χρονοβόρες και απαιτούν την παρουσία εξειδικευμένου και έμπειρου προσωπικού, όπως επίσης και την χρήση υψηλού κόστους εξοπλισμού. Επιπλέον, δεν έχουν την ικανότητα διεξαγωγής αναλύσεων τοξικών ουσιών επί τόπου και σε πραγματικό χρόνο. Σε αυτή τη μελέτη αναπτύχθηκε μια καινοτόμος διάταξη κυτταρικού βιοαισθητήρα, για την ανίχνευση υπολειμμάτων φυτοπροστατευτικών ουσιών, βασιζόμενη στη μέτρηση των αλλαγών του μεμβρανικού δυναμικού ακινητοποιημένων κυττάρων, σύμφωνα με την αρχή λειτουργίας της μεθόδου βιοηλεκτρικής αναγνώρισης BERA (Bioelectric Recognioon Assay). Ta κύτταρα ακινητοποιήθηκαν σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου (1η μέθοδος) και σε πλακίδια με αγαρόζη (2η μέθοδος), προκειμένου να διατηρηθούν οι φυσιολογικές τους λειτουργίες. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές: N2a (καρκινικά κύτταρα νευροβλαστώματος), Vero (νεφρικά κύτταρα πράσινου πιθήκου) και φυτικά κύτταρα (πρωτοπλάστες από φύλλα καπνού Nico%ana tabacum). Συνολικά μελετήθηκε η απόκριση των κυτταρικών βιοαισθητήρων σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις, (1ppb, 10ppb, 100ppb, 500ppb και 1ppm), ενός ακαρεοκτόνου (fenbutaon oxide) και ενός εντομοκτόνου (imidacloprid). Η χρήση αυτών των κυτταρικών βιοαισθητήρων οδήγησε κυρίως σε ποιοτική και σε ορισμένες περιπτώσεις ποσοτική ανίχνευση των φυτοφαρμάκων, καθώς και σε υψηλούς βαθμούς επαναληψιμότητας.

An extensive use of pesocides has been observed in agricultural pracoce, therefore reliable methods are required for the detecoon of residues in food. Two of the most important categories of pesocides used in agricultural producoon are the insecocides and acaricides (biocides). These compounds are frequently found in food, whereas convenoonal methods of analysis, chromatographic and spectroscopic techniques, are sufficiently sensiove but ome-­‐consuming, and require the presence of specialized and experienced personnel, as well as the use of highly expensive equipment. Also, these standard analysis methods have not the ability to detect toxic substances in real ome. In the present study, a novel cell-­‐biosensory method has been developed for the detecoon of pesocides residues, based on the measurement of changes of the cell membrane potenoal of immobilized cells, according to the working principle of the Bioelectric Recognioon Assay. The cells were immobilized by entrapment in a sodium alginate bead (1st method) and in an agarose ole (2nd method), in order to preserve their physiological funcoons. Three different kind of cell lines have been used; N2a (neuroblastoma cancer cells), Vero (kidney cells from green monkey) and plant cells (protoplasts from leaves of Nico%ana tabacum). This study presents the response of the cellular biosensors to five different concentraoons, (1ppm, 500ppb, 100ppb, 10ppb, 1ppb), of one acaricide (fenbutaon oxide) and one insecocide (imidacloprid). The use of these cellular biosensors resulted in qualitaove and in some cases quanotaove detecoon of the pesocides and a high degree of reproducibility.