Λειτουργία της πρωτεΐνης Lefkothea απουσία του καρβόξυ-τελικού άκρου

Abstract

Μια από τις απαραίτητες διαδικασίες για την λειτουργία του κυττάρου είναι η σωστή κατανομή των πρωτεϊνών στα διάφορα οργανίδια. Για τον σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί εξειδικευμένοι μηχανισμοί μέσω των οποίων οι διάφορες πρωτεΐνες, μετά την μετάφρασή τους, τοποθετούνται σε ένα ή περισσότερα οργανίδια στα οποία απαιτούνται. Μία τέτοια πρωτεΐνη είναι η LEFKOTHEA, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο At5g62990 του Arabidopsis thaliana. Η LEFKOTHEA τοποθετείται τόσο στον πυρήνα όσο και στον χλωροπλάστη και η λειτουργία της είναι απαραίτητη στα πρώτα στάδια της εμβρυογένεσης. Η αμινοξική της ακολουθία περιλαμβάνει ένα πεπτίδιο συνθήματος για στόχευση στον χλωροπλάστη, σινιάλα εισόδου και εξόδου από τον πυρήνα καθώς και μία περιοχή πρόσδεσης στο RNA. Μία μετάλλαξη που οδηγεί σε υποκατάσταση της γλυκίνης στη θέση 373 από ασπαρτικό οξύ έχει ως αποτέλεσμα την διατάραξη της κατανομής της πρωτεϊνης στον πυρήνα και δίνει φυτά με χαρακτηριστικές λευκές κοτυλιδόνες. Ο φαινότυπος αυτός αποκαθίσταται με μετασχηματισμό των φυτών με γονιδιακή κατασκευή της LEFKOTHEA από την οποία απουσιάζει το πεπτίδιο συνθήματος για τον χλωροπλάστη. Ανοσοανίχνευση με το κατάλληλο αντίσωμα σε παροδικά μετασχηματισμένα φύλλα καπνού με την συγκεκριμένη γονιδιακή κατασκευή, έδειξε πως η πρωτεΐνη παρουσιάζει πολλαπλές ζώνες στο gel ηλεκτροφόρησης, το οποίο πιθανόν να οφείλεται με την ύπαρξη μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων. Για τη διερεύνηση της πιθανής παρουσίας μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων στην πρωτεΐνη LEFKOTHEA η έρευνα επικεντρώθηκε στο καρβοξυτελικό της άκρο, όπου με τη βοήθεια βιοπληροφορικής ανάλυσης βρέθηκε μία ομαδοποίηση σερινών που εμφανίζουν υψηλή πιθανότητα φωσφορυλίωσης. Δημιουργήθηκε μία γονιδιακή κατασκευή από την οποία απουσιάζει τόσο το πεπτίδιο στόχευσης στον χλωροπλάστη, όσο και ολόκληρο το καρβοξυτελικό άκρο. Ανοσοανίχνευση με το κατάλληλο αντίσωμα σε παροδικά μετασχηματισμένα φύλλα καπνού με την συγκεκριμένη γονιδιακή κατασκευή έδειξε πως όταν απουσιάζει το καρβοξυτελικό άκρο η πρωτεϊνη εμφανίζεται ως μία μόνο ζώνη, ενώ παρουσία του καρβοξυτελικού άκρου εμφανίζονται δύο επιπλέον ζώνες με ελαφρά αυξημένο μοριακό βάρος. Μικροσκοπία φθορισμού έδειξε πως απουσία του καρβοξυτελικού άκρου η πρωτεΐνη εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στον πυρηνίσκο, ενώ κατά την παρουσία του εντοπίζεται σε στικτές περιοχές του πυρήνα. Το αποτέλεσμα αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα πως το καρβοξυτελικό άκρο παίζει ρόλο στην τοποθέτηση της πρωτεΐνης σε συγκεκριμένες περιοχές του πυρήνα. Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της λειτουργίας της πρωτεΐνης LEFKOTHEA που δεν διαθέτει το καρβοξυτελικό άκρο. Για τον λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε μόνιμος μετασχηματισμός σε μεταλλάγματα lefko2 με την συγκεκριμένη γονιδιακή κατασκευή. Στην T3 γενεά των διαγονιδιακών φυτών πραγματοποιήθηκε συλλογή δυο καθαρών γονιδιακών σειρών #3-1 και #1-4. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε σύγκριση των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των συγκεκριμένων σειρών με φυτά αγρίου τύπου, μεταλλάγματος lefko2 και διαγονιδιακών φυτών 35S::(ΔTP)lefko-YFP-Flag. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν φαίνεται πως τα φυτά 35S::(ΔTP)lefkoΔC-FLAG παρουσιάζουν διαφορετικό πρότυπο ανάπτυξης ως προς το μήκος της ρίζας και την περιεκτικότητα των φυτών σε φωτοσυνθετικές ουσίες, τόσο με το μετάλλαγμα lefko2 όσο και με φυτά 35S::(ΔTP)lefko-YFP-Flag και αγρίου τύπου.

One of the important processes of cell function is the proper protein distribution in various organelles. For this reason, specific mechanisms have been developed via of which various proteins, after their translation, are placed in one or more organelles of which they are demanded. LEFKOTHEA is one of these proteins and is encoded by the At5g62990 gene of Arabidopsis thaliana. LEFKOTHEA is placed both in nucleus and chloroplast and its function is necessary in the first steps of embryogenesis. The amino acid sequence includes a peptide signal for targeting in chloroplast, signals for localization and export from nucleus and an RNA binding region. A mutation which causes the substitution of glycine 373 by aspartic acid has as consequence the disturbance of protein distribution in nucleus and the formation of white cotyledons in plants. This phenotype is restored in plants transformed with a gene structure of LEFKOTHEA missing the peptide signal for chloroplast. Immunodetection with the proper antibody in transient transformed tobacco’s leaves with this gene structure has shown that the protein presents multiple bands in the electrophoretic gel, which are probably related to posttranslational modification. In order to investigate the presence of possible posttranslational modification in protein LEFKOTHEA the research was focused on the carboxyl- terminus end, where bioinformatics analysis that showed a group of serines with high possibility of phosphorylation. A gene structure has been created, missing both the peptide signal for chloroplast and the whole C-terminus. Immunodetection with the proper antibody in transient transformed tobacco’s leaves with the certain gene structure has shown that in the absence of carboxyl- terminus end the protein shows one band, while in the presence of carboxyl- terminus end shows two more bands with a slightly higher molecular weight. Fluorescence microscopy in transient transformed tobacco’s leaves with this gene structure has shown that in the absence of carboxyl- terminus end the protein is localized mostly in nucleolus, while in the presence of carboxyl- terminus end protein localized in spotted regions of nuclear. This results in conclusion that carboxyl- terminus end has a major role in the placement of the protein in specific regions of the nucleus. The aim of this work was the study the function of protein LEFKOTHEA which lack of carboxyl- terminus end. To accomplish this task, steady transformation in mutans lefko2 with this gene structure was performed. At the T3 generation of these transgenic plants, a selection of two pure genetic lines #3-1 και #1-4 was been accomplished. Afterward, the phenotype of these genetic lines was compared with wild type plants, mutans lefko2 and transgenic plants with gene structure 35S::(ΔTP)lefko-YFP-Flag. From the following results, it seems that the 35S::(ΔTP)lefkoΔC-Flag plants show different growth pattern in root length and plant content in photosynthetic pigments, compared both to mutant lefko2 and 35S::(ΔTP)lefko-YFP-Flag and wild-type plants.