Διερεύνηση του in vitro πολλαπλασιασμού του Arbutus unedo var. rubra και συγκριτική μελέτη της συγκέντρωσης των ολικών φαινολικών του με άλλων ειδών Arbutus

Abstract

Το Arbutus unedo var. rubra Aiton (f. Ericaceae, Συν. var. croomii) είναι μία φυσική ποικιλία του Arbutus unedo L. και είναι επίσης γνωστό με την ονομασία Pink strawberry tree ή ρόδινη κουμαριά. Είναι φυτό ιδιαίτερα εντυπωσιακό και ελκυστικό όπως και το Arbutus unedo, από τον Οκτώβριο έως και τον Ιανουάριο, με την ιδιαιτερότητα ότι την εποχή αυτή, ταυτόχρονα με τους πορτοκαλοκόκκινους καρπούς, σχηματίζει ρόδινα άνθη, έναντι των λευκών ανθέων του A. unedo. H διαφοροποίηση αυτή του προσδίδει ιδιαίτερη καλλωπιστική αξία και θα μπορούσε να σχηματίσει πολύ εντυπωσιακές συνθέσεις, σε συνδυασμό με τα άλλα είδη Arbutus, στο αστικό και περιαστικό τοπίο και επίσης θα μπορούσε να αξιοποιηθεί στην ανθοκομία για την παραγωγή δρεπτών κλάδων. Επιπλέον, όπως και τα άλλα είδη του γένους Arbutus, μπορεί να αξιοποιηθεί σε αναδασώσεις λόγω της ικανότητας τους να αναβλαστάνουν γρήγορα μετά από πυρκαγιά αλλά και στη φαρμακοβιομηχανία λόγω της υψηλής συγκέντρωσης σε ολικά φαινολικά που παρατηρήθηκε στα εκχυλίσματα των φύλλων του. Στη βιβλιογραφία δεν βρέθηκαν αναφορές σχετικά με οποιαδήποτε μέθοδο πολλαπλασιασμού της ποικιλίας A. unedo var. rubra. Έτσι, στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκε για πρώτη φορά μία πλήρης μέθοδος για τον in vitro πολλαπλασιασμό του φυτού ξεκινώντας από ενήλικο αυτοφυές φυτό που φύονταν σε δάσος αείφυλλων σκληρόφυλλων στην περιοχή της Βαρυμπόμπης του Ν. Αττικής και από σπορόφυτα ανεπτυγμένα in vitro. Η πρώτη προσπάθεια εγκατάστασης καλλιεργειών έγινε με έκφυτα προερχόμενα από in vitro ανεπτυγμένα σπορόφυτα και διερευνήθηκε η επίδραση τόσο των κυτοκινινών, ZEA και TDZ (σε συγκεντρώσεις 2,5 ή 5,0 mg l-1 και 0,2 ή 2,0 mg l-1, αντίστοιχα), όσο και των θρεπτικών υποστρωμάτων, MS και WPM, στην in vitro βλαστογένεση της ποικιλίας. Τα αποτελέσματα της μελέτης, υποδεικνύουν τη ZEA ως αποτελεσματική φυτορυθμιστική ουσία, ανεξαρτήτως δοκιμασθείσας συγκέντρωσης, ενώ το TDZ κρίθηκε ακατάλληλο, καθώς προκάλεσε το σχηματισμό παραμορφωμένων, μικρού μήκους βλαστών και τη δημιουργία κάλου. Ακολούθησαν υποκαλλιέργειες κατά τις οποίες διερευνήθηκε, και στο στάδιο αυτό, η επίδραση του είδους του θρεπτικού υποστρώματος (WPM και MS) και η αποτελεσματικότητα της ZEA στην παραγωγή βλαστών, σε ποικίλες συγκεντρώσεις 0,5, 2,5 και 5,0 mg l-1, αλλά και η συνδυασμένη επίδραση 2,5 mg l-1 ZEA με NAA σε συγκέντρωση 0,1 mg l-1, με στόχο την επίτευξη επιμήκυνσης των μικροβλαστών. Σε όλα τα υποστρώματα σημειώθηκε υψηλό ποσοστό βλαστογένεσης, ενώ σε υπόστρωμα MS με 5,0 mg l-1 ΖΕΑ σχηματίστηκαν περισσότεροι βλαστοί ανά έκφυτο. Το μήκος των παραγόμενων βλαστών ήταν μικρό σε όλες τις μεταχειρίσεις και η προσθήκη NAA στο υπόστρωμα δεν συνετέλεσε στην επιμήκυνση τους. Για τον μικροπολλαπλασιασμό του A. unedo var. rubra με χρήση μητρικού υλικού από ενήλικο αυτοφυές φυτό η αρχική εγκατάσταση ήταν επιτυχής και σημειώθηκε αρκετά υψηλό ποσοστό βλαστογένεσης σε WPM με 2,5 mg l-1 ZEA ενώ μικρότερη συγκέντρωση ΖΕΑ (0,5 mg l-1) προτείνεται για το στάδιο του πολλαπλασιασμού των καλλιεργειών, η οποία επέφερε παρόμοια παραγωγή βλαστών με τη χρήση ZEA σε υψηλότερες συγκεντρώσεις. Η ριζοβολία των μικροβλαστών έγινε σε πολύ υψηλά ποσοστά που άγγιζαν το 100% σε μισής συγκέντρωσης WPM με 1 mg l-1 IBA, ανεξάρτητα της ενήλικης ή νεανικής προέλευσης των μικροβλαστών και ο εγκλιματισμός των φυταρίων σε ex vitro συνθήκες ήταν απόλυτα επιτυχής σε υπόστρωμα τύρφης: περλίτη (1:1, v/v). Επίσης, στην παρούσα μελέτη, έγινε φωτομετρικός προσδιορισμός των ολικών φαινολικών συστατικών των τριών κυρίαρχων ειδών Arbutus που απαντώνται στην Ελληνική χλωρίδα (A. unedo, Arbutus andrachne L. και του φυσικού τους υβριδίου Αrbutus x andrachnoides) καθώς και της ποικιλίας A. unedo var. rubra σε δείγματα φύλλων που συλλέχθηκαν το Μάϊο από την κορυφή των βλαστών (νέα βλάστηση) και από χαμηλότερα στο βλαστό (παλαιά βλάστηση). Επίσης, συλλέχθηκαν κατά το στάδιο της ανθοφορίας δείγματα φύλλων ακριβώς κάτω από την ταξιανθία, δηλαδή Απρίλιο από το A. andrachne και Δεκέμβριο από τα άλλα taxa. Ανεξάρτητα από το στάδιο συλλογής, και τα τέσσερα taxa ήταν πλούσια σε ολικά φαινολικά συστατικά. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν διακύμανση της συγκέντρωσης ανάμεσα στα είδη. Το A. unedo var. rubra εμφάνισε την υψηλότερη συγκέντρωση ολικών φαινολικών συγκριτικά με τα άλλα τρία είδη, χωρίς σημαντική διαφορά από το A. unedo L. Λαμβάνοντας υπόψιν το στάδιο ανάπτυξης και την ηλικία της βλάστησης, υψηλότερη συγκέντρωση παρατηρήθηκε σε φύλλα νέας βλάστησης του A. unedo var. rubra σχεδόν σε διπλάσια ποσότητα από αυτή της παλαιάς. Στα A. unedo και A. x andrachnoides παρατηρήθηκε υψηλότερη συγκέντρωση ολικών φαινολικών σε φύλλα παλαιάς βλάστησης σε σχέση με τα φύλλα νέας βλάστησης, ενώ στο A. Andrachne δεν υπήρξε σημαντική διαφορά.

Arbutus unedo var. rubra Aiton (f. Ericaceae, syn. var. croomii) is a pink-flowered form of Arbutus unedo L. and it’s also known as Pink strawberry tree. It is a very impressive and attractive plant like Arbutus unedo L., from October to January, while it forms rosery flowers, instead of white flowers of A. unedo, along with its orange-red strawberry-like fruits at the same time. This differentiation gives it a great ornamental value and the plant could form very impressive compositions, combined with the other species of Arbutus, in the urban and suburban landscapes and could also be used in floriculture to produce cut foliage. Furthermore, it can be used in reforestations because of its ability to re-sprout easily after fire, like other species of the genus Arbutus, as well as in the pharmaceutical industry due to its high concentration in total phenolic compounds observed in its leaf extracts. In literature, there are no reports on any propagation method of A. unedo var. rubra. Thus, in the present study an efficient protocol for the in vitro propagation of the plant was developed for the first time starting from a wild, adult plant located on the southeast side of mount Parnitha, Varympompi, Attiki and from seedlings cultured in vitro. The first attempt for cultures establishment was carried out with explants derived from seedlings. Both the effectiveness of cytokinins, ZEA and TDZ (at concentrations of 2,5 or 5,0 mg l-1 and 0,2 or 2,0 mg l-1, respectively), and the type of medium, MS and WPM, were investigated. Our results indicate the effectiveness of ZEA regardless of its concentration. TDZ was considered inappropriate while it formed short, deformed shoots and induced callus formation. At the following subcultures, the effectiveness of medium type (WPM and MS) and ZEA at various concentrations 0,5, 2,5 and 5,0 mg l-1 and ZEA at 2,5 mg l-1 in combination with NAA at 0,1 mg l-1 were also tested. In all treatments, explants produced shoots at high percentage and more shoots per explant were formed on MS medium supplemented with 5,0 mg l-1 ZEA. Shoot length was small in all treatments and the addition of NAA to the medium did not manage to induce longer shoots. Considering cultures established from an adult plant, it was totally successful and WPM with 2,5 mg l-1 ZEA formed shoots in high percentages. ZEA at lower concentration (0,5 mg l-1) was recommended for the shoot multiplication stage. Rooting percentage was high, almost 100 %, on half strength WPM supplemented with 1 mg l-1 IBA independently of the origin of the microshoots. Ex vitro acclimatization of plantlets was 100% successful on peat: perlite (1:1, v/v). Moreover, in the present study, total phenolic content of the three predominant Arbutus species (A. unedo L., Arbutus andrachne L. and their natural hybrid Αrbutus x andrachnoides), as well as A. unedo var. rubra was determined. Samples of leaves were collected in May from the top of the stem (new vegetation) and from lower to the stem (old vegetation). Leaves were also collected at the flowering stage, just below the inflorescence, in April from A. andrachne and in December from the other taxa. Regardless of the collection stage, all four taxa were rich in total phenolic compounds. The results of the present study showed a variation in the concentration among the species. A. unedo var. rubra presented the highest concentration of total phenols compared to the other three species, with no significant difference from A. unedo L. Considering the growth stage and the age of the vegetation, the highest concentration was observed in new vegetation leaves of A. unedo var. rubra and it was almost twice as much as that of the old one. Old vegetation leaves of A. unedo and A. x andrachnoides showed higher concentration of total phenols than that of new vegetation leaves, while in A. andrachne there was no significant difference.