Επίδραση της συγκέντρωσης γλυκόζης στην παραγωγή βιομάζας και στη βιοσύνθεση λιπιδίων του εδώδιμου και φαρμακευτικού μύκητα Agrocybe aegerita κατά την καλλιέργειά του σε υγρές ζυμώσεις

Abstract

Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της επίδρασης της συγκέντρωσης γλυκόζης στη φυσιολογία του εδώδιμου – φαρμακευτικού μύκητα Agrocybe aegerita κατά τη διάρκεια καλλιέργειάς του σε υγρή κατάσταση. Συγκεκριμένα, αυτοφυές στέλεχος του μανιταριού A. aegerita καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο με συγκέντρωση γλυκόζης ~ 30 g/L ( C/N=20, μάρτυρας) και ~ 65 g/L (C/N=40) και εξετάστηκε η επίδραση της γλυκόζης στην ποσότητα της παραγόμενης βιομάζας του μανιταριού (μυκήλιο), στην παραγωγή των ενδοπολυσακχαριτών και στη συγκέντρωση και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των λιπιδίων της. Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό των λιπιδίων των μυκηλίων με εκχύλιση, προσδιορίστηκαν ποιοτικά και ποσοτικά οι κύριες τάξεις λιπιδίων με τη βοήθεια χρωματογραφικών τεχνικών (υγρή χρωματογραφία στήλης, TLC). Παράλληλα, αναπτύχθηκε μεθοδολογία για την in situ μετεστεροποίηση των λιπιδίων και τον μετέπειτα ποσοτικό προσδιορισμό των λιπαρών οξέων (ως μεθυλεστέρες) με αέρια χρωματογραφία. Σε ό,τι αφορά την κυτταρική αύξηση του μακρομύκητα, καταγράφηκε υψηλή συγκέντρωση βιομάζας και στα δύο υποστρώματα φτάνοντας την τελευταία μέρα της ζύμωσης σε ~ 21 g/L. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μεγάλη παραγωγή ενδοπολυσακχαριτών (65% επι της ξηρής βιομάζας), γεγονός που υποδειξνύει την φαρμακευτική δράση του μανιταριού. Η συσσώρευση ενδοκυτταρικού λίπους και στις δύο περιπτώσεις δεν ξεπέρασε το 4% επί ξηρής βιομάζας, ενώ παρατηρήθηκε λίγο μεγαλύτερη ποσότητα λίπους (~1%) στην καλλιέργεια με την μικρή συγκέντρωση γλυκόζης στο υπόστρωμα. Ποιοτική ανάλυση μέσω TLC των λιπιδίων έδειξε πως τα κύρια ουδέτερα λιπίδια είναι οι τριακυλογλυκερόλες, οι στερόλες και οι κηροί, ενώ τα κύρια φωσφολιπίδια είναι η φωσφατιδυλοχολίνη και η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη. Ποσοτική ανάλυση μέσω αέριας χρωματογραφίας μεθυλεστέρων, οι οποίοι προέκυψαν από απευθείας μετεστεροποίηση στη βιομάζα, έδειξε πως και στις δύο συνθήκες ζύμωσης τα κύρια λιπαρά οξέα ήταν το παλμιτικό (16:0), το στεατικό (18:0), το ελαϊκό (18:1) και το λινελαϊκό οξύ (18:2). Το λινελαϊκό οξύ ήταν το κυρίαρχο λιπαρό οξύ με ποσοστό 47-75% w/w του συνόλου των λιπαρών οξέων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η αύξηση του ελαικού οξέος κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας καθώς ξεκινάει με ποσοστό 5,67% του συνόλου των λιπαρών οξέων την 13 ημέρα της καλλιέργειας και φτάνει το 32% τις τελευταίες μέρες της καλλιέργειας. Τέλος, έγινε προσπάθεια ποσοτικού προσδιορισμού των τάξεων των λιπιδίων από την επεξεργασία της ψηφιακής εικόνας της πλάκας TLC το λογισμικό ΙmageJ, αλλά τα αποτελέσματα δεν ήταν τόσο ικανοποιητικά. Η παρούσα μελέτη είναι πρωτότυπη διότι καθώς υπάρχει έλλειψη βιβλιογραφίας σχετικά με τη βιοσυνθετική ικανότητα λιπιδίων του μακρομύκητα A. aegerita, διεξήχθησαν προηγμένες βιο-φυσιολογικές μελέτες σε σχέση με την ανάπτυξη του, καθώς και τον προσδιορισμό του λιπιδικού του προφίλ του σε υγρές καλλιέργειες.

The purpose of this study is to investigate the effect of variable concentration of glucose in the physiology of the edible - medicinal fungus Agrocybe aegerita during its cultivation in liquid batch cultures. More specifically, a wild strain of mushroom A. aegerita was cultured in nutrient medium with high glucose (~ 65 g/L) and was compared with low-concentration cultures (~30 g/L). Also the effect of glucose on the amount of the produced mycelial biomass and the biosynthesis of its lipids was examined. After quantification of lipids of mycelium by extraction, the main classes of lipids were determined qualitatively and quantitatively by means of chromatographic techniques (column chromatography, TLC). At the same time, a methodology was developed for the in situ transesterification of lipids and subsequent quantitative determination of fatty acids (as methyl esters) by gas chromatography. The mushroom grew normally on both substrates reaching the last day of the fermentation a DCW concentration of ~ 21 g/L. Worth to mention is the high production of intracellular polysaccharides 65% of dry biomass, which indicates the potential interest of this m/o as cell factory able to produce medicinally significant metabolites. Intracellular lipid accumulation in both cases did not exceed 4% on dry biomass, which is reasonable since this fungus is a non-oleaginous one. Little more lipids (<1%) were observed in the culture with low glucose concentration in the substrate. TLC analysis of lipids showed that the major neutral lipids are triacyglycerol, sterols and waxes while the main phospholipids identified were phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. Quantitative analysis by gas chromatography of methyl esters which resulted from direct methylesterification in biomass showed that in both fermentation conditions the main fatty acids were palmitic acid (16: 0), steatic acid (18: 0), oleic acid (18: 1) and linoleic acid (18: 2). Linoleic acid was the predominant fatty acid with 47-75% w/w of total lipids. Oleic acid starts with a percentage of 5.67% of total fatty acids at 13 days of cultivation and significantly increased to 32% in the last days. Finally, an attempt was made to quantify the lipids through a TLC plate and ImageJ software but the results were not as satisfactory. The present study is original because in general there is a lack of relevant bibliography on the lipid biosynthetic ability of the specific strain of fungus and also because advanced bio-physiological studies in relation with the growth of this fungus and determination of its lipid profile in liquid cultures were carried out.