Αντικατάσταση μικροβιολογικών αναλύσεων χοιρινού κιμά με τη χρήση αισθητήρων

Abstract

Την τελευταία δεκαετία, παρουσιάζεται ραγδαία αύξηση στην κατανάλωση αλλά και στην σπατάλη του κόκκινου κρέατος και ιδίως του χοιρινού. Για να αποφευχθεί η σπατάλη αυτή, κρίνεται αναγκαία η εύρεση σύγχρονων μεθόδων εκτίμησης του βαθμού αλλοίωσης και της διάρκειας ζωής του νωπού και επεξεργασμένου κρέατος. Μία μη επεμβατική και ταχεία μέθοδος που χρησιμοποιείται στον τομέα των τροφίμων είναι η πολυφασματική απεικόνιση. Βασικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η συσχέτιση των μικροβιολογικών αποτελεσμάτων από πειράματα αλλοίωσης χοιρινού κιμά με τα δεδομένα που προέκυψαν από την εφαρμογή της πολυφασματικής απεικόνισης. Με βάση τα δεδομένα αυτά αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν μοντέλα εκμάθησης για την ποιοτική και ποσοτική εκτίμηση του βαθμού αλλοίωσης του κιμά. Επίσης, από τα μικροβιολογικά δεδομένα προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της μικροβιακής ανάπτυξης της μικροχλωρίδας του χοιρινού κιμά και μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στον ειδικό ρυθμό ανάπτυξης των μικροοργανισμών. Για τον σκοπό αυτό, διεξήχθησαν δύο ανεξάρτητα πειράματα συντήρησης χοιρινού κιμά σε διαφορετικές συνθήκες ατμόσφαιρας και θερμοκρασίας. Πιο συγκεκριμένα, αξιολογήθηκαν δύο διαφορετικοί τύποι συσκευασίας,αερόβιες και τροποποιημένες ατμοσφαιρικές συνθήκες συσκευασίας (80% O2- 20% CO2), ενώ ο χοιρινος κιμάς συντηρήθηκε τόσο σε ισόθερμες συνθήκες (4, 8, 12 οC) όσο σε ένα δυναμικό θερμοκρασιακό προφίλ (περιοδική μεταξύ 4 οC,8 οC και 12 οC), για συνολικό χρονικό διάστημα 15 ημερών. Δειγματοληψία πραγματοποιούταν σε τακτά χρονικά διαστήματα (14- 24 ώρες) σε δύο δείγματα ανά θερμοκρασιακό προφίλ, διεξάγονταν μικροβιολογικές αναλύσεις και εφαρμοζόταν η μέθοδος της πολυφασματικής απεικονίσης. Όσον αφορά στην δημιουργία των μοντέλων εκμάθησης, και για τις δύο περιπτώσεις συσκευασίας, τα δεδομένα που αξιοποιήθηκαν ως δείγματα εκπαίδευσης ήταν τα μικροβιολογικά και τα πολυφασματικά των 4, 8, 12 οC, ενώ ως δείγματα ελέγχου των μοντέλων ήταν αυτά του δυναμικού θερμοκρασιακού προφίλ. Τα δεδομένα μετασχηματίστηκαν σε κανονικές τυπικές μεταβλητές με μετασχηματισμό SNV. Ο αλγόριθμος που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του μοντέλου εκτίμησης της ολικής μεσόφιλης μικροχλωρίδας (ΟΜΧ) στον κιμά, ήταν η γραμμική παλινδρόμηση με τη μέθοδο των μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS- R). Ως ανεξάρτητες μεταβλητές ορίστηκαν τα πολυφασματικά δεδομένα (n= 36) και ως εξαρτημένη ο πληθυσμός της ΟΜΧ. Για την ποιοτική εκτίμηση της αλλοίωσης του χοιρινού κιμά, εφαρμόστηκε η διακριτική ανάλυση με τη μέθοδο μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS- DA) και η διακριτική ανάλυση παραγόντων (DFA). Ορίστηκαν τρεις κλάσεις αλλοίωσης, βάσει της νομοθεσίας (EK 2073/2005), ως εξής: φρέσκο (κλάση 1) με ΟΜΧ μικρότερη από 5.7 log CFU/g, οριακά φρέσκο (κλάση 2) με ΟΜΧ μεταξύ 5.7 και 6.7 log CFU/g και αλλοιωμένο (κλάση 3) με ΟΜΧ μεγαλύτερη από 6.7 log CFU/g. Επιπλέον, δημιουργήθηκε μοντέλο ταξινόμησης σε δύο κλάσεις, στο οποίο τα οριακά φρέσκα δείγματα ορίστηκαν ως φρέσκα ή αλλοιωμένα με γνώμονα την πιθανότητα ταξινόμησης στην αντίστοιχη κλάση (Baeysian prior). Ως ανεξάρτητες μεταβλητές χρησιμοποιήθηκαν τα πολυφασματικά δεδομένα (n= 36), και ως εξαρτημένες οι τρεις κλάσεις σε δυαδική μορφή (για το μοντέλο των τριών κλάσεων) και οι δύο κλάσεις (για το μοντέλο των δύο κλάσεων). Από τα μικροβιολογικά αποτελέσματα και τα πρωτογενή μοντέλα μικροβιακής ανάπτυξης φάνηκε ότι η θερμοκρασία και η ατμόσφαιρα επηρέασαν σε σημαντικό βαθμό τη μικροβιολογική αλλοίωση του χοιρινού κιμά. Στην περίπτωση της αερόβιας συσκευασίας, κυρίαρχος αλλοιωγόνος μικροοργανισμός στον κιμά ήταν βακτήρια του γένους Pseudomonas, των οποίων η φάση προσαρμογής αυξήθηκε με την μείωση της θερμοκρασίας συντήρησης, με μεγαλύτερη τιμή τις 29.98 ώρες για τους 4 oC και μικρότερη τις 17.077 ώρες για τους 12 oC. Κατά την συντήρηση υπό τροποποιημένες ατμόσφαιρες κυριάρχησαν βακτήρια του είδους Brochothrix thermosphacta καθώς και τα οξυγαλακτικά βακτήρια ενώ η παρεμποδιστική δραση της θερμοκρασίας ήταν αυξημένη για τις θερμοκρασίες των 4 και 8 oC. Τα μοντέλα PLS- R εμφάνισαν καλή επίδοση, καθώς κατά πρόβλεψη η τιμή του RMEp ήταν ίση με 1.017 και 0.892, για την αερόβια και την τροποποιημένη ατμόσφαιρα αντιστοίχως, ενώ οι αντίστοιχες τιμές του rp ήταν 1.186 και 0.781. Από τους συντελεστές β φάνηκε ότι τα μήκη κύματος που επηρεάζουν την επίδοση του μοντέλου, και στις δύο συνθήκες συσκευασίας, ήταν αυτά που σχετίζονται με την μυογλοβίνη, την οξυμυογλοβίνη και τη μεταμυογλοβίνη. Τα μοντέλα PLS- DA των τριών κατηγοριών αλλοίωσης πρόβλεψαν σε λιγότερο ικανοποιητικό βαθμό την κλάση του οριακά φρέσκου και η συνολική ακρίβεια κατά την πρόβλεψη ήταν 84.48 % για τον αέρα και 79.63 % για την τροποποιημένη ατμόσφαιρα. Ταυτόχρονα, τα μοντέλα διαχωρισμού των δύο κλάσεων παρουσίασαν συνολική ακρίβεια πρόβλεψης 91.38 % για τον αέρα και 75.93 % για την τροποποιημένη ατμόσφαιρα, ενώ δεν αλληλοεπικαλύπτονταν οι δυο κλάσεις. Τέλος, τα μοντέλα DFA των τριών κλάσεων, εμφάνισαν κατά την πρόβλεψη συνολική ακρίβεια, 77.59 % για τον αέρα και 75.93 % για την τροποποιημένη ατμοσφαιρική συσκευασία και ταυτόχρονα μπόρεσαν να διαχωρίσουν σε καλύτερο βαθμό από τα μοντέλα PLS- DA την κλάση των οριακά φρέσκων από τις άλλες δύο. Συμπερασματικά, φάνηκε ότι ο συνδυασμός της θερμοκρασίας ψύξης και των τροποποιημένων ατμοσφαιρικών συνθηκών επηρέασε σε σημαντικό βαθμό στον ρυθμό αλλοίωσης των δειγμάτων χοιρινού κιμά κατά την συντήρηση του. Τα γραμμικά μοντέλα προσδιορισμού της ΟΜΧ πρόβλεψαν σε ικανοποιητικό βαθμό τον πληθυσμό των μικροβίων, και ταυτόχρονα τα γραμμικά μοντέλα της ποιοτικής εκτίμησης της αλλοίωσης του κιμά διαχώρισαν ικανοποιητικά τις δύο κλάσεις. Περαιτέρω βελτίωση των μοντέλων πιθανόν να ήταν ορατή με αύξηση του αριθμού των δειγμάτων ενώ θα μπορούσε να γίνει διερεύνηση της σχέσης μικροβιακών και πολυφασματικών δεδομένων με τη χρήση μη- γραμμικών μοντέλων.

In the last decade, the consumption and waste of fresh red meat, especially pork, have been rapidly increased. In an effort to avoid this massive foodwaste, food scientists are seeking for new rapid methods capable of accurately estimating the spoilage status and the shelf life of food products. Multispectral imaging is a promising, rapid, noninvasive optical technique, which is recently used in food science. The aim of this research was to investigate the correlation between conventional microbiological analysis and multi- spectral imaging in samples of stored minced pork. Qualitative and quantitative models based on multispectral imaging data were developed and evaluated, while growth kinetic parameters of the spoilage microorganisms were estimated and the effect of storage temperature on microbial growth rate was also assessed. For this purpose, portions of minced pork were stored under isothermal (4, 8 and 12 °C) conditions and a dynamic temperature profile (periodic temperature changes from 4 to 12 °C) in aerobic and modified atmosphere packaging (80% O2-20% CO2). In each packaging type, two independed experiments were performed for a maximum time period of 15 days. At regular time intervals during storage, duplicate samples were subjected to microbiological analysis and MSI acquisition. For the construction of all types of machine learning models, training samples were the microbiological and spectral data of 4, 8 and 12 °C, whereas model validation was performed using the data collected from the dynamic temperature profile. Data were pre- processed using Standard Normal Variate (SNV) transformation. The Partial Least Square- Regression (PLS-R) algorithm was used for the estimation of total viable counts (TVC) in pork samples. Independent and dependent variables were spectral data and TVC, respectively, in both types of packaging. In addition, for the qualitative assessing the deterioration of pork, Partial Least Square- Discriminant Analysis (PLS: DA) and Discriminant Factor Analysis (DFA) were performed. Three microbiological classes were defined according to the Commission Regulation (EC) No 2073/2005, as: fresh for TVC lower than 5.7 logCFU/g; semi- fresh for TVC between 5.7 and 6.7 log CFU/g; and spoiled for TVC higher than 6.7 log CFU/g. Moreover, models of two classes were built, in which semi- fresh class was classified in the class of fresh or spoiled based on Bayesian prior. Independent variables were spectral data (n= 36) and dependent variables (n=3) were the three classes of spoilage. For the model of two classes, dependent variables (n=2) were the two classes, fresh and spoiled. Microbiological experiments and primary model results showed that storage and packaging conditions influenced the growth of microorganisms. In aerobic conditions, the specific spoilage organisms for the samples of stored pork were Pseudomonas spp., followed by Brochothrix thermosphacta and LAB. Additionally, the lag phase of Pseudomonas spp. was increased with decreasing temperature, with the longest lag time being 29.98 h during storage at 4 oC and the shortest being 17.077 h during storage at 12 oC. Reversibly, Brochothrix thermosphacta and LAB were dominant microorganisms in samples stored under MAP conditions and the impact of low temperatures (i.e. 4 and 8 oC) affected negatively the growth of those two bacterial groups. PLS-R models exhibited good performance and the values of the correlation coefficient (r) and the root mean square error (RMSE) for the prediction were 0.892 and 1.017, for aerobic conditions, respectively, while for MAP conditions were 0.781 and 1.186, respectively. Furthermore, b- coefficients showed that the wavelengths with the highest effect on model performance, for both cases of packaging, corresponded to myoglobin, oxymyoglobin and metmyoglobin. PLS- DA models for the three classes exhibited poor performance with regard to the classification of semi- fresh samples, and the total accuracy of the prediction for aerobic conditions was 84.48 % and for MAP conditions 79.63 %. In contrast, total accuracy of prediction for the aerobic packaging model of two classes was increased to 91.38 %, whereas for MAP packaging was only 75.93 %. Meanwhile, DFA models of three classes ehibited good performance for all categories of spoilage, since total accuracy of performance determined to be 77.59 and 75.93% for aerobic and MAP storage, respectively. In conclusion, the level of spoilage on pork samples was influenced by temperature and modified atmosphere packaging. Both linear models for qualitative and quantitative estimation of shelf life of minced pork were shown good performance. However, a higher number of training data could improve model performance and accuracy, while a no-linear algorithm could explain better the relation of microbiological to spectral data.