Κλωνοποίηση, έκφραση του ενζύμου SIRT και μελέτη αλληλεπίδρασης του με βιοδραστικά εκχυλίσματα

Abstract

Οι σιρτουίνες (Sirtuins) είναι μια οικογένεια πρωτεϊνών καλά συντηρημένη, η οποία απαντάται σχεδόν σε όλους τους οργανισμούς. Στα θηλαστικά εντοπίζονται επτά μέλη της οικογένειας, οι SIRT1-7. Οι βασικές λειτουργίες που εκτελούν είναι η αποακετυλώση πρωτεϊνών και η μεταφορά της ADP-ριβόζης, με τη συμμετοχή του συμπαράγοντα NAD+. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας, ήταν η μελέτη της αναστολής ή της ενεργοποίησης που επιφέρουν βιοδραστικά εκχυλίσματα φυτών και μικροφυκών, στη δραστικότητα του ενζύμου SIRT2. Επιπλέον η κλωνοποίηση του γονιδίου που εκφράζει το ένζυμο σε βακτηριακά κύτταρα E.coli, η επαγωγή της έκφρασης του ενζύμου και ο καθαρισμός του. Προκειμένου να επιτευχθεί ο σκοπός αυτός, αρχικά δημιουργήθηκαν εκχυλίσματα, από τους οργανισμούς που επιλέχθηκαν και ελέγχθηκε η επίδραση αυτών στη δραστικότητα του ενζύμου. Ταυτόχρονα, σε όλα τα εκχυλίσματα που δημιουργήθηκαν, υπολογίστηκε η περιεκτικότητα σε φαινολικές ουσίες με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, και η αντιοξειδωτική τους ικανότητα με τις μεθόδους ORAC, FRAP και DPPH•. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχουν εκχυλίσματα που ενεργοποιούν και αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Συγκεκριμένα, τα εκχυλίσματα από ψυχανθή, προκάλεσαν τη μεγαλύτερη ενεργοποίηση στη SIRT2 ενώ αντίθετα, τα εκχυλίσματα από τα φυτά Hibiscus sp., Taraxacum officinale και Crocus sativus, παρουσίασαν τη μεγαλύτερη αναστολή του ενζύμου. Από τις μετρήσεις που έγιναν, φαίνεται ότι σύμφωνα με τις μεθόδους ORAC, FRAP και DPPH•, τα εκχυλίσματα από Taraxacum officinale, Curcuma longa, Crocus sativus, Cinnamomum verum και Hibiscus sp. έχουν υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα ενώ το εκχύλισμα από Cinnamomum verum είναι πλούσιο σε φαινολικές ουσίες, όπως υπολογίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu. Στη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του γονιδίου που εκφράζει τη SIRT2 στον πλασμιδιακό φορέα pEXP5-CT/TOPO®. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο εισήχθη σε δεκτικά βακτηριακά κύτταρα E. coli (Stellar) προκειμένου να απομονωθεί το DNA τους και να επιβεβαιωθεί η ένθεση της σωστής αλληλουχίας. Ακολούθως, το ίδιο πλασμίδο εισήχθη σε εκφραστικά κύτταρα E. coli (BL21(DE3) και BL21(DE3) Rosetta), προκειμένου να αναλυθούν οι πρωτεΐνες που εκφράζουν και να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη του ενζύμου SIRT2. Τέλος, πραγματοποιήθηκε καθαρισμός με μεταλλοχηλική χρωματογραφία συγγένειας.

Sirtuins are a class of NAD+-dependent deacetylases, which are highly conserved and have beneficial health effects. They are also function as ADP-ribosyltransferases. Members of this family can be detected in almost all organisms, and specifically in mammals, there are seven isoforms, SIRT1-7. The purpose of this research was to study the inhibition or activation that is caused to the enzyme SIRT2, by bioactive extracts from plants and algae. In addition, the cloning of the gene that expresses SIRT2 in bacterial E.coli cells, the induction of enzyme expression and finally its purification. In order to achieve this goal, extracts were initially generated from the organisms selected and their effect on enzyme activity was measured. At the same time, in all extracts that were generated, the content of phenolic substances was calculated by the Folin-Ciocalteu method, and their total antioxidant activity was measured by ORAC, FRAP and DPPH• methods. The results showed that there are extracts that activate and extracts that inhibit the activity of the enzyme. In particular, legume extracts caused the highest activation in SIRT2 whereas, on the contrary, extracts from the plants Hibiscus sp., Taraxacum officinale and Crocus sativus showed the highest inhibition of the enzyme. From the measurements made, it appears that according to the ORAC, FRAP and DPPH• methods, extracts of Taraxacum officinale, Curcuma longa, Crocus sativus, Cinnamomum verum and Hibiscus sp. have a high antioxidant capacity while the Cinnamomum verum extract is rich in phenolic substances, as calculated by the Folin-Ciocalteu method. Following the experimental procedure, the gene expressing SIRT2 was cloned into the plasmid vector pEXP5-CT/TOPO®. The recombinant plasmid used to transform eligible Escherichia coli bacterial cells, in order to make them produce SIRT2. By isolating and sequencing their DNA, it was possible to confirm the insertion of the correct sequence. Subsequently, the same plasmid used to transform expressing Escherichia coli cells (BL21 (DE3) and BL21 (DE3) Rosetta) to analyze the proteins they express and to confirm the existence of the SIRT2 enzyme. Finally, purification by metal ion affinity chromatography was performed.