Μελέτη του μικροοικοσυστήματος παραδοσιακού κεφίρ

Abstract

Το ρόφημα ζαχαρούχου κεφίρ παράγεται με ζύμωση διαλύματος ακατέργαστης ζάχαρης με κόκκους κεφίρ, με τους τελευταίους να αποτελούν μια συμβιωτική σχέση διαφορετικών μικροοργανισμών, κυρίως οξυγαλακτικών βακτηρίων και ζυμών και περιστασιακά βακτηρίων οξικού οξέος, προσκολλημένων σε ένα ελαστικό πλέγμα πολυσακχαρίτη, γνωστό ως κεφιράν. Στην παρούσα ερευνητική μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά δείγματα κόκκων κεφίρ, μήλου, βύσσινου και νερού με ζάχαρη και δαμάσκηνα, τα οποία αποτελούσαν μικροβιακή συλλογή του Εργαστηρίου Ποιοτικού Ελέγχου & Υγιεινής Τροφίμων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών, που αποτελούν το μικροοικοσύστημα του κεφίρ καθώς και η μελέτη των τεχνολογικών ιδιοτήτων, που σχετίζονται με την παραγωγή του, όπως η δυνατότητα πρωτεόλυσης, λιπόλυσης, το δυναμικό οξίνισης και η αντιμικροβιακή δράση έναντι του παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes. Τέλος πραγματοποιήθηκε η παρασκευή του ροφήματος κεφίρ σύμφωνα με παραδοσιακή μέθοδο, από τα στελέχη εκείνα των οξυγαλακτικών βακτηρίων και των ζυμών, με τις καλύτερες ιδιότητες, κάτι που συνοδεύτηκε από πρότυπο οργανοληπτικής αξιολόγησης. Η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών επιτεύχθηκε με τη χρήση κλασικών τεχνικών (culture-dependent) και τεχνικών που δεν περιλαμβάνουν την καλλιέργεια τους (culture-independent). Στην πρώτη περίπτωση επιλέχθηκε η PCR-RAPD και η αλληλούχηση του DNA, ως πρότυπα μικροβιακής ταυτοποίησης, με τα είδη των ζυμών να ταυτοποιούνται ως S. cerevisiae και K. marxianus και αυτά των βακτηρίων ως Lb. rhamnosus και B. amyloliquefaciens. Στη δεύτερη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε η PCR-DGGE, με άμεση εκχύλιση του RNA των ζυμών και των βακτηρίων, τόσο για την ανίχνευση μη καλλιεργήσιμων στελεχών όσο και για την επιβεβαίωση της παρουσίας των στελεχών εκείνων, που ταυτοποιήθηκαν μέσω της αλληλούχησης, επιβεβαιώνοντας την παρουσία των S. cerevisiae και K. marxianus σε επίπεδο ζυμών, ενώ ηλεκτροφορητική κινητικότητα δεν παρουσιάστηκε σε επίπεδο βακτηρίων. Αναφορικά με τις ιδιότητες του ροφήματος κεφίρ, η πρωτεολυτική δραστηριότητα αξιολογήθηκε με δύο προσεγγίσεις, πρώτα με τη μέθοδο διάχυσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, όπου 13 στελέχη θετικά στη δοκιμή πρωτεολυτικής δράσης (9 ζύμες και 5 βακτήρια) ελέγχθηκαν και με δεύτερη μέθοδο, αυτή της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με δωδεκυλο-θειικό νάτριο, χωρίς ωστόσο να επιβεβαιώνεται το παραπάνω πρωτεϊνικό προφίλ, συνιστώντας μερική καζεϊνολυτική δράση των στελεχών αυτών. Με τη χρήση δύο μεθόδων πραγματοποιήθηκε και ο έλεγχος της λιπολυτικής δράσης, με τα αποτελέσματα να είναι σε πλήρη συμφωνία μεταξύ τους και χαρακτηρίζοντας λιπολυτικά 40 και 45 στελέχη βακτηρίων και ζυμών, αντίστοιχα. Υψηλές τιμές οξίνισης εμφάνισαν τα στελέχη των οξυγαλακτικών βακτηρίων, που ανήκουν στο είδος του Lb. rhamnosus, ενώ κανένα στέλεχος ούτε σε επίπεδο ζυμών ούτε σε αυτό των βακτηρίων δεν παρουσίασε αντιμικροβιακή δράση έναντι της Listeria monocytogenes. Όσο αφορά στην οργανοληπτική αξιολόγηση των ροφημάτων κεφίρ που παρασκευάστηκαν, θετικά εκτιμήθηκαν εκείνα που παρήχθησαν από ενοφθαλμισμό πλήρους γάλακτος με τη μονοκαλλιέργεια LQC 2014 και τη συγκαλλιέργεια των LQC 2014-10167, ενώ η απαρίθμηση των μικροβιακών αποικιών των ροφημάτων έδειξε την ύπαρξη των βακτηρίων κατά 109 και αυτή των ζυμών κατά 108 CFU/mL, αντίστοιχα, τόσο σε επίπεδο μονοκαλλιέργειας όσο και συγκαλλιέργειας των δύο παραπάνω.

Sugary kefir beverage is produced by fermenting a raw sugar solution with kefir grains, the latter consisting of a symbiotic consortium of different microorganisms, mainly lactic acid bacteria (LAB) and yeasts, and occasionally acetic acid bacteria embedded into a resilient polysaccharide-protein matrix, named kefiran. Three different samples of kefir grains, apple, cherry, and water enriched with sugar and plums, were used in this study. The aim of this study was to identify the microorganisms constituting the microecosystem of traditional kefir as well as to study the technological properties associated with its production, such as proteolytic, lipolytic capability, acidification potential and antimicrobial activity against pathogenic microorganism Listeria monocytogenes. Finally, the kefir beverage was produced according to a traditional method, from bacterial and yeast strains equipped with the most appropriate properties, which was accompanied by an organoleptic evaluation model. The microbial identification was achieved by using both culture-dependent and -independent techniques. In the first case, PCR-RAPD and DNA sequencing were selected as microbial identification models, with yeast species having been identified as Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus and those of bacteria as Lactobacillus rhamnosus and Bacillus amyloliquefaciens. As far as the culture-independent approach was concerned, PCR-DGGE was used, based on direct extraction of yeast and bacterial RNA, not only for the detection of non-cultivable strains, but also for confirming the presence of those species identified by sequencing. At yeast level, the presence of S. cerevisiae and K. marxianus was confirmed, whereas regarding the bacterial one, no electrophoretic mobility was performed. As for the properties of the microorganisms isolated, proteolytic activity was evaluated based on two approaches. Firstly, the method of Agar Well Diffusion Assay was performed, where 13 strains (9 yeasts and 5 lactic acid bacteria) exhibited proteolytic activity and were further tested by the second one, that of Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), suggesting a partial caseinolytic activity by these strains. The assessment of lipolytic activity was performed by a combined method of agar well diffusion assay and subsequent test of lipase secretion capability. As a result 40 bacterial and 45 yeast strains, accordingly, were characterized as lipolytic. LAB strains performed high acidification capability, while no antimicrobial activity was screened. As for the sensory evaluation of the kefir beverages domestically produced, those produced by full fat milk inoculation with monoculture of Lb rhamnosus (strain LQC 2014) and co-culture of Lb. rhamnosus and S. cerevisiae (LQC strains 2014-10167) were positively evaluated and highly appreciated.