Εκτίμηση υποθανάτιων καταπονήσεων που σχετίζονται με το περιβάλλον επεξεργασίας τροφίμων που προκαλούν κυτταρικό τραυματισμό και ή/και απώλεια καλλιεργησιμότητας σε εργαστηριακά υποστρώματα στον παθογόνο μικροοργανισμό Listeria monocytogenes

Abstract

Ο παθογόνος μικροοργανισμός Listeria (L.) monocytogenes τροφιμογενούς προέλευσης συναντάται σε ένα ευρύ φάσμα οικολογικών θώκων περιλαμβανομένου του νερού, του χώματος, της βλάστησης και των ζώων. Χώροι επεξεργασίας τροφίμων, μη επεξεργασμένα τρόφιμα και τρόφιμα έτοιμα προς κατανάλωση (RTE) εύκολα επιμολύνονται με το βακτήριο μέσω φορέων. Η λιστερίωση είναι μία αυξανόμενα απαντώμενη και δυνητικά θανατηφόρος ασθένεια η οποία προκαλείται από λοίμωξη με τον μικροοργανισμό L. monocytogenes. Ο μικροοργανισμός L. monocytogenes δύναται να επιβιώσει κάτω από πληθώρα συνθηκών που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία τροφίμων με σκοπό την επεξεργασία τροφίμων και την βεβαίωση της ασφάλειας. Οι συνθήκες αυτές περιλαμβάνουν υψηλές θερμοκρασίες, όξινα περιβάλλοντα, προσθήκη αλάτων, περιβάλλοντα με απουσία θρεπτικών στοιχείων και χρήση απολυμαντικών. Για το βακτήριο όλα τα παραπάνω θεωρούνται καταπονήσεις. Υπό συνθήκες καταπόνησης, το μικροβιακό κύτταρο δύναται να παραμείνει υγιές, εάν η καταπόνηση είναι ήπια, λόγω της ενεργοποίησης μηχανισμών ανάδρασης. Οι φυσιολογικές μεταβολές που λαμβάνουν χώρα στο κύτταρο, του επιτρέπουν να προσαρμοστεί στις νέες συνθήκες του περιβάλλοντος και να αποκτήσει ανθεκτικότητα στην συγκεκριμένη καταπόνηση, μεταξύ άλλων. Ωστόσο, όταν η καταπόνηση είναι εντονότερη, τα κύτταρα τραυματίζονται υποθανάτια. Αυτό σημαίνει ότι πολλά κυτταρικά συστατικά και μεταβολικά μονοπάτια χάνουν μέρος της λειτουργικότητας τους ανάλογα με τον τρόπο δράσης της καταπόνησης. Ο τραυματισμός είναι ένα αναστρέψιμο φαινόμενο, δηλαδή εάν τα κύτταρα δεν θανατωθούν, αλλά αντ’ αυτού τραυματιστούν υποθανάτια κατά την επεξεργασία τροφίμων ή τις διαδικασίες απολύμανσης των χώρων επεξεργασίας τροφίμων, μπορούν να ανακάμψουν. Η κατανάλωση τροφίμων που περιέχουν τραυματισμένους υποπληθυσμούς του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes, ενέχει κινδύνους για την δημόσια ασφάλεια, συνεπώς η ύπαρξη τραυματισμένων κυττάρων στα τρόφιμα αποτελεί απειλή για την ασφάλεια των τροφίμων. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ποσοτική αξιολόγηση του υποθανάτιου τραυματισμού σε κύτταρα του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes υπό συνθήκες καταπόνησης που σχετίζονται με την επεξεργασία και περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίμων. Συγκεκριμένα, δύο βακτηριακά στελέχη, το ScottA (ορότυπος 4b) και το EGD-e (ορότυπος 1/2a) υποβλήθηκαν σε θερμική καταπόνηση, όξινη καταπόνηση από γαλακτικό οξύ pH 3.0, στον συχνά χρησιμοποιούμενο απολυμαντικό παράγοντα Benzalkonium Chloride (BC), σε λιμό και σε συνθήκες λιμού με προσθήκη άλατος. Ο παράγοντας καταπόνησης διαλύθηκε σε ένα από τα δύο μέσα, το Ringer και το νερό Microcosm και έπειτα από την αρχική έκθεση του εμβολίου, το μέγεθος του οποίου ήταν 109 βακτηριακά κύτταρα μέσης στατικής φάσης, τα βακτήρια επωάζονταν σε δύο θερμοκρασίες 4οC ή 20o C. Ένας επιπλέον στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η σύγκριση του υποθανάτιου τραυματισμού στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες. Ο υποθανάτιος τραυματισμός αξιολογήθηκε με την χρήση επιλεκτικών και μη επιλεκτικών μέσων. Το TSAYE ήταν το μη επιλεκτικό μέσο στο οποίο όλα τα ζωντανά καλλιεργήσιμα βακτηριακά κύτταρα θα σχημάτιζαν αποικίες. Το TSAYE+NaCl χρησιμοποιήθηκε ως επιλεκτικό μέσο. Τα υποθανάτια τραυματισμένα κύτταρα δεν σχημάτιζαν αποικίες στον επιλεκτικό παράγοντα λόγω έλλειψης ικανότητας να ανταπεξέλθουν στην ήπια καταπόνηση στην οποία υποβάλλονται από το μέσο. Για κάθε στέλεχος, φάση ανάπτυξης και μέγεθος εμβολίου, η συγκέντρωση άλατος που διαχωρίζει με ακρίβεια τα υγιή από τα τραυματισμένα κύτταρα πιθανώς διαφέρει. Οι δοκιμές εύρεσης της Μέγιστης Μη Ανασταλτικής συγκέντρωσης (MNIC), καθορίζουν την μέγιστη συγκέντρωση άλατος που δεν αναστέλλει την ανάπτυξη των βακτηρίων, αυτή η συγκέντρωση χρησιμοποιείται για την παρασκευή του επιλεκτικού μέσου. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε και για τα δύο στελέχη TSAYE με 5%NaCl w/v. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης και το students t-test, για να ανιχνευτούν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των πληθυσμών που εκτιμώνται στα επιλεκτικά και μη επιλεκτικά μέσα, γεγονός που υποδεικνύει τραυματισμό, καθώς και διαφορές ανάμεσα σε δείγματα που επωάζονται υπό διαφορετικές πειραματικές συνθήκες. Η επιβίωση και ο υποθανάτιος τραυματισμός του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes, διέφερε μεταξύ καταπονήσεων, μεταξύ πειραματικών συνθηκών στην ίδια καταπόνηση και μεταξύ χρονικών σημείων στο ίδιο δείγμα. Συνολικά, υποθανάτιος τραυματισμός ανιχνεύτηκε σε κάθε μεταχείριση. Ωστόσο, διαφορετικές καταπονήσεις προκάλεσαν διαφορετικά επίπεδα τραυματισμού ακόμα και σε χρονικές στιγμές που η μείωση του πληθυσμού ήταν η ίδια. Στην μελέτη του όξινου περιβάλλοντος, το μέσο θεωρείται ως ο σημαντικότερος παράγοντας που καθορίζει τον υποθανάτιο τραυματισμό. Τα δείγματα που επωάστηκαν σε Microcosm έδειξαν μεγαλύτερο ποσοστό τραυματισμού από ότι στο Ringer στους 4οC, και ο τραυματισμός των δειγμάτων στους 4οC ήταν περισσότερος από τον τραυματισμό των αντίστοιχων κυττάρων στους 20οC. Η διαφορά μεταξύ των στελεχών οφείλονταν στην θερμοκρασία. Στην περίπτωση του BC, τα κύτταρα που διαλύθηκαν στο Microcosm παρουσίασαν μεγαλύτερο %τραυματισμό, στους 20οC. Ο τραυματισμός εξαρτήθηκε από τον χρόνο και τα βακτήρια στους 20οC τραυματίστηκαν σε περισσότερο ποσοστό από τα αντίστοιχα δείγματα που επωάστηκαν στους 4οC. Παρατηρήθηκε διαφοροποίηση μεταξύ των στελεχών η οποία αποδόθηκε στα διαφορετικά μέσα και θερμοκρασίες επώασης. Όταν τα βακτηριακά κύτταρα L. monocytogenes θερμάνθηκαν στους 55oC για 120 λεπτά, δεν βρέθηκαν μεταξύ των δειγμάτων σε καμία χρονική στιγμή στατιστικά σημαντικές διαφορές αναφορικά με την μείωση του πληθυσμού. Τα κύτταρα του στελέχους ScottA εμφάνισαν σημαντικά περισσότερο %τραυματισμό όταν διαλύθηκαν στο μέσο Ringer συγκριτικά με το Microcosm. Υπό συνθήκες απουσίας θρεπτικών συστατικών, μέρος του βακτηριακού πληθυσμού στα περισσότερα δείγματα επιβίωσε για 8 εβδομάδες. Ο τραυματισμός ήταν πιο εκτεταμένος στο μέσο Microcosm συγκριτικά με το Ringer και καθορίστηκε κυρίως από την θερμοκρασία. Στους 20οC, τα κύτταρα είχαν ελάχιστο αρχικό υποθανάτιο τραυματισμό, ο οποίος αυξήθηκε όσο τα κύτταρα εκτίθενται στην καταπόνηση. Στους 4οC, ο %τραυματισμός ήταν μικρότερος και παρουσίασε αυξομειώσεις σε διαφορετικά χρονικά σημεία ενώ το μέγεθος του πληθυσμού παρέμεινε σταθερό. Παρατηρήθηκε επίσης διαφοροποίηση μεταξύ στελεχών. Όταν στο μέσο διάλυσης προστέθηκε άλας, σε συνδυασμό με έλλειψη θρεπτικών στοιχείων, ο υποθανάτιος τραυματισμός που εντοπίστηκε ήταν σημαντικά λιγότερος συγκριτικά με την καταπόνηση λιμού. Το στέλεχος EGD-e εμφάνισε μεγαλύτερο τραυματισμό από το ScottA και η θερμοκρασία επώασης είχε επίσης ρόλο στον υποθανάτιο τραυματισμό, καθώς τα κύτταρα στους 20οC τραυματίστηκαν σε μεγαλύτερο ποσοστό συγκριτικά με τους 4οC. Στο μέσο Ringer προκλήθηκε μεγαλύτερος τραυματισμός από ότι στο Microcosm. Η παρούσα μελέτη εντάσσεται και θα μπορούσε να συνεισφέρει στην γενικότερη προσπάθεια στην επιστήμη τροφίμων για την αναγνώριση και την καλύτερη κατανόηση των κινδύνων που ο υποθανάτιος τραυματισμός ενέχει για την ασφάλεια τροφίμων. Ειδικότερα στην περίπτωση του παθογόνου μικροοργανισμού τροφιμογενούς προέλευσης Listeria monocytogenes, η ανάγκη για σχεδιασμό αποτελεσματικών πρακτικών επεξεργασίας και απολύμανσης είναι πρωτεύουσας σημασίας.

Listeria (L.) monocytogenes is an ubiquitous foodborne pathogen commonly found in reservoirs such as water, soil, plantation and animals. Food processing environments, raw materials and RTE foods are easily contaminated through carriers. Listeriosis is an increasingly occurrent and possibly lethal medical condition caused by L.monocytogenes infection. L. monocytogenes is able to overcome and survive a wide range of conditions utilized by the food industry in order to minimally process foods and secure safety. These include high temperatures, acidic environments, addition of salts, environments where nutrition elements are absent and the use of disinfectants. All these factors are considered as stresses by the bacterial cells. Under stress conditions, it is possible for the microbial cell to remain healthy, assuming the stress is mild. This is because of stress response mechanisms that are being activated. The cell undergoes physiological alterations that allow it to adapt to the new environment and become resistant to the particular stress among others. However, in cases when a more severe stress is applied, the cells become sublethaly injured. This amounts to several cell components and metabolic pathways losing part of their functionality, depending on the mode of action of the stress. Sublethal injury is a reversible phenomenon, meaning that in case bacterial cells don’t perish, but instead get injured during plant disinfection or food process, they can recover. The implications associated with the consumption of food containing injured subpopulations of Listeria monocytogenes, are a considerable threat to food safety. The aim of the present study is to assess in a quantitative matter the extent of sublethal injury of Listeria monocytogenes cells under stress conditions associated with food processing and food processing environments. More specifically, two bacterial strains, ScottA (serotype 4b) and EGD-e (serotype 1/2a) were subjected to heat stress, acidic stress due to lactic acid, the commonly used disinfectant agent Benzalkonium Chloride (BC), starvation and starvation conditions with the addition of salt in the medium. The stress agent was dissolved in either one of two mediums, Ringer or Microcosm Water and after the initial exposure of 109 CFU inoculum of bacteria in mid stationary growth phase, the cells were incubated in two temperatures, 4oC or 20OC. The comparison of the sublethal injury among different experimental conditions was also an aspect of this study. The sublethal injury was assessed by using selective and nonselective substrates. TSAYE was the nonselective medium, meaning that all alive and culturable cells would form colonies when spread to the medium. TSAYE + NaCl was chosen as the selective medium. Sublethaly injured cells would not form colonies in the selective medium due to the loss of the ability to overcome the mild stress subjected to them by that medium. For every strain, growth phase and inoculum size, the concentration of NaCl that can accurately separate the healthy from the sublethaly injured cells, may be different. The MNIC test determines the maximum concentration of NaCl that is not by itself inhibitory for the bacterial growth, this concentration is used for the composition of the selective media. In the case of the present study, 5%NaCl w/v was found to be the MNIC for both strains. Results were analyzed by using analysis of variance and students t-test in order to detect statistically significant differences between salt concentrations within the same sample, indicating injury, as well as differences between samples under different experimental conditions. The survival and sublethal injury of Listeria monocytogenes differed significantly between stresses, between conditions under the same stress and between time points within the same sample type. Overall, statistically significant sublethal injury was present during every treatment. However, different stresses caused different injury levels, even at timepoints when the population decrease was the same. In the studies concerning acidic stress, the dilution medium is considered to be the most important factor, defining sublethal injury. Samples dissolved in Microcosm Water showed greater percentage of injury than in Ringer in 4oC and the injury of samples incubated at 4oC was considerably greater than the injury of samples incubated at 20oC. Temperature was identified as the source of strain variation. In the case of BC, cells diluted in Microcosm Water exhibited greater injury at 20oC. Sublethal injury was time-dependent and greater in the samples incubated in 20oC than those in 4oC. Strain variation was present and attributed to the different media and temperatures. When Listeria monocytogenes cells were heated at 55oC for 120minutes, no statistically significant difference was found between the reduction of different samples at any given timepoint. The bacteria belonging to ScottA strain exhibited a greater percentage of injury when incubated in Ringer compared to Microcosm. Under starvation conditions, part of the cell population in most samples survived for 8 weeks. Bacteria diluted in Microcosm Water exhibited a greater percentage of sublethal injury, compared to Ringer and injury was mostly defined by temperature. At 20oC, samples had no statistically significant original injury, which increased as exposure to stress increased. At 4oC, injury was smaller and was increased and then decreased at different time points as sample population remained mostly stable. Strain variation was present. When 7% NaCl was added to the dilution medium in combination with starvation, the sublethal injury exhibited by cells was significantly smaller compared to starvation. EGD-e strain exhibited significantly greater injury than ScottA, and incubation temperature proved to be of importance, as samples incubated in 20oC were injured in a greater extend compared to samples in 4oC. The medium Ringer contained more %injured cells than Microcosm Water. The present study is part and could contribute to the greater effort put by food science in order to identify and better understand the potential risks bacterial sublethal injury harbors for food safety. Especially in the case of the foodborne pathogen Listeria monocytogenes, the need to design effective processes and disinfectant strategies, cannot be understated